关键词:JAZF1基因 脂肪细胞 肝细胞 脂代谢 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2实验方法

1.2.1质粒大量抽提

将鉴定过的pGenesil-JAZF1-3重组质粒的菌液进行大量扩增并提取质粒,以备后续大规模实验使用。操作步骤如下:

(1)将2.5ml平衡液加入吸附柱中,于室温离心10000rpm×2min,弃收集管中废液,将吸附柱重新装回收集管上;

(2)将各菌液分别加入离心管中,室温离心10000rpm×3min,弃上清收集沉淀;

(3)向上述沉淀加入7mlP1溶液,重悬细菌;

(4)加入7mlP2溶液,立即颠倒混匀,室温静置5min,直至菌液变清亮;

(5)再向离心管中加入7mlP4溶液,立即颠倒混匀以避免局部沉淀,至出现白色絮状悬浮物,室温静置约10min,离心10000rpm×5min,将上清液全部倒入过滤器中,缓慢推动推柄过滤,用50ml无菌离心管收集滤液;

(6)向滤液中加入异丙醇(为滤液体积的0.3倍),轻轻颠倒混匀后分两次转移至吸附柱中;

(7)室温离心10000rpm×2min,将滤液二次过柱,以提高得率,弃废液,吸附柱再次装回收集管;

(8)向吸附柱中加入10mlPW漂洗液(已加无水乙醇),离心10000rpm×2min,弃废液,吸附柱重新装回;

(9)向吸附柱中加入3ml无水乙醇,离心10000rpm×2min,弃去废液后将吸附柱装回收集管上再次离心,以去除残余漂洗液;

(10)将CP5吸附柱置于50ml无菌收集管中,向柱子中央加1ml预热的洗脱液,室温静置5min,离心10000rpm×5min,将洗脱液二次上柱离心,条件同前,洗脱液转入无菌Ep管中,测定浓度及纯度并标记,存于-20℃备用。

1.2.4细胞葡萄糖摄取率(GUR)测定

于24孔细胞培养板内接种3T3-L1前脂肪细胞,按前述方法将各组重组质粒转染诱导分化成熟后的脂肪细胞,转染后48h分别收集各组细胞,用2-脱氧-3H-D葡萄糖摄入法(2-DOG)测定各组脂肪细胞GUR。分别检测在基础状态下和胰岛素刺激状态下各组脂肪细胞GUR的变化。共分4组,每组设3个复孔,进行实验重复2次。操作步骤:(1)弃去细胞培养残液→37℃预热的KRHBufferr轻轻洗涤×3次→加入1ml不含血清的DMEM(含0.2%的BSA)培养液,37℃,孵育3h;(2)再加入450µl的KRHB(胰岛素处理组加入100nm的胰岛素),37℃,孵育30min;(3)添加50ul含1mmol/L2-DOG(0.5μCi)的KRHB/孔,孵育10min→预冷的KRHBuffer洗涤×3次,终止反应。(4)弃去上清→加0.5mL0.2mmol/L的NaOH孵育4hr→加入0.25ml0.4mol/L的HCl中和→反复吹打裂解细胞。(5)用10ml刻度吸管准确分次吸取15ml闪烁液加入到仪器配用的专用闪烁杯中,吸取细胞裂解物0.4ml,加入闪烁杯中,关紧杯盖,置于室温过夜。(6)使用LS6500型液闪仪计数混合液每分钟衰变率。用各组细胞每分钟衰变率间接反映其葡萄糖摄取率(GUR)。

1.2.5细胞免疫荧光

将3T3-L1细胞和Hepa1-6细胞分别接种于铺有无菌盖玻片的12孔板中,Hepa1-6细胞培养2天后爬片完成,3T3-L1细胞经诱导分化为成熟脂肪细胞后完成爬片。细胞荧光染色步骤如下:

(1)固定:PBS手工5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。固定液覆盖细胞,室温静置固定15min。加入PBS,于振荡器5min×3次振荡洗涤。

(2)透膜:0.5%TritonX-100覆盖细胞,室温静置30min。PBS5min×3次振荡洗涤。

(3)封闭:封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h(注意保湿)。

(4)一抗孵育:一抗用PBS以1:100浓度稀释,覆盖标本表面。4℃孵育过夜。PBS5min×3次振荡洗涤。

(5)二抗孵育:FITC标记二抗以1:100-200浓度稀释于PBS,覆盖标本表面。37℃避光孵育60min。PBS5min×3次避光振荡洗涤。

(6)染核:新鲜配置的染核染液覆盖细胞表面,室温避光静置2-3min。PBS5min×3次避光振荡洗涤。

(7)封片:在干净的载玻片上滴一滴50%甘油封片,将爬片的细胞面扣在液滴上。

(8)正置荧光显微镜镜检,于4℃冰箱避光保存。

1.2.6脂肪细胞脂质积累测定

(1)于6孔细胞培养板内接种3T3-L1前脂肪细胞,将其诱导分化成熟后按前述方法转染各组重组质粒,转染后72h后观察细胞大体形态。(2)弃去细胞培养残液,用PBSBuffer洗涤细胞×3次,每培养孔加入1ml10%多聚甲醛溶液,室温固定30min。(3)弃去多聚甲醛溶液,每培养孔加入2ml0.3%油红O工作溶液,室温染色15min。(4)每培养孔加入2mlPBSBuffer于脱色摇床上洗涤,5min×3次,至液体无色。(5)每培养孔加入1ml60%异丙醇,于脱色摇床摇床上脱色10min。(6)用紫外分光光度计检测各孔吸光度值(OD值,λ=490nm)

1.2.7Westernblot检测蛋白表达

(1)细胞蛋白提取小心收集细胞,迅速加PBS清洗2次4℃离心→1000g×5min加入200µl蛋白抽提液RIPA及2µlPMSF(100mM),混匀,冰上裂解30min4℃离心→12000g×30min将上清液转移至EP管中,并测定浓度→与5×SDS上样buffer(还原型)混合(4:1)→100℃沸煮5min-80℃保存备用

(3)SDS-PAGE凝胶电泳按照下列步骤操作:

安装干净的玻璃板→配制分离胶溶液(含12%丙烯酰胺)→轻轻混合均匀灌入玻璃夹层中,距玻璃板顶端2cm处即可,在其上层覆盖1ml无水乙醇37℃→静置30min凝胶完全聚合后弃去无水乙醇,用滤纸除去残留液体→配制积层胶(含5%丙烯酰胺)→轻轻混合均匀灌入两块玻璃夹层中,插上成型梳子37℃→静置30min积层胶完全聚合后,小心拔去梳子,用电泳缓冲液冲洗加样孔,在电泳槽内外加入适量电泳缓冲液→把蛋白样本和蛋白Maker加到各上样孔内(100µg/孔),用1×SDS上样buffer将各孔补足至同一体积(包括无蛋白样本的上样孔)→接通电源,以恒压80V电泳约30min,直至染料即将进入分离胶,将电压调节为120V继续电泳约1.5h,直至溴酚蓝抵达分离胶底部

(4)转膜(半干转法)

电泳完毕后,把凝胶从玻璃板中取出,按所检测蛋白分子量大小,切取相应位置的凝胶,浸泡在负极转膜缓冲液中;同时剪切与胶相同大小的厚滤纸(两张)和PVDF膜,一张浸泡在负极转膜缓冲液中,另一张浸泡在正极转膜缓冲液中;PVDF膜经甲醇平衡30s→ddH2O,2min→正极转膜缓冲液,20min。按此顺序组装:正极滤纸(底层)→PVDF膜→凝胶→负极滤纸→负极盖子。接通电源,恒流0.1A,根据不同分子量转印15~40min。

(5)封闭

把转印好的PVDF膜放到TBST溶液漂洗1min,再转移到5%蛋白封闭液中,4℃封闭过夜。

(6)孵育抗体用5%蛋白封闭液稀释一抗:兔抗小鼠β-actin多克隆抗体1:1000;兔抗小鼠GLUT-1单克隆抗体1:1000;兔抗小鼠GLUT-4多克隆抗体1:500;兔抗小鼠Insiga2多克隆抗体1:1000;兔抗小鼠Visfatin多克隆抗体1:100;兔抗小鼠Acrp30多克隆抗体1:200;兔抗小鼠PPAR-γ多克隆抗体1:1000;兔抗小鼠PEPCK多克隆抗体1:1000;兔抗小鼠HSL多克隆抗体1:500。把PVDF膜置于蜡板上,将稀释的一抗加在PVDF膜上,4℃孵育过夜。将PVDF膜置于平皿中,用TBST洗涤10min×2次,TBS洗涤10min×1次。将PVDF膜置于干净蜡板上,吸去残留液体,加入稀释好的二抗溶液(羊抗兔IgG二抗用TBST稀释1:1000),室温静置1.5h,用TBST洗涤10min×2次,TBS洗涤10min×1次,浸在TBS

中待显色成像。

(7)化学发光检测及成像将PVDF膜置于蜡板上,取化学发光检测试剂A液、B液等体积混匀,覆盖在膜上,室温避光反应30s,置于化学发光检测仪内检测发光强度并成像。用QuantityOne软件分析条带灰度值,目的蛋白的相对表达量,用目的条带与内参条带灰度值之比来表示。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)