关键词:小鼠 JAZF1-shRNA 真核表达载体 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2.1.1载体构建

(1)制备感受态细菌

  DH5α细菌于37℃培养箱培养16h后,挑取单个菌落→转到一个含有5mlLB培养液的聚丙烯离心管(50ml)→在37℃恒温摇床中180rpm震荡培养12h→取细菌悬液50μl接种到含有5mlLB培养液的聚丙烯离心管(50ml)37℃摇床→180rmp震荡培养2~3h浑浊程度达到透过菌液恰好看不到文字时,将菌液全部转移到用冰预冷的聚丙烯离心管(50ml)冰上静置20min→4℃离心4000g×10min弃上清液,吸去残留液体,加入10ml0.1M冰上预冷的CaCl2(先加1ml轻轻悬起细菌,再加9ml混匀)静置30min→4℃离心4000g×10min弃上清液,吸去残留液体,加入冰预冷含20%甘油的0.1MCaCl2溶液,→轻轻混匀用1.5mlEP管分装,每支200μl,标记后-80℃冰箱保存

(2)合成单链目的基因片段的退火连接

  化学合成前述设计好的6条寡核苷酸片段,分别用30μl退火buffer溶解各前述单链目的基因(1OD)片段。各取2μl(即2μlA+2μlB)+16μl退火buffer混匀后,置于94℃退火,自然冷却至室温,将退火产物稀释100倍备用,即各取1μl退火产物+99μl无菌水混匀。

(3)pGenesil-1.2质粒线性化

  以Eco31I酶切模板质粒,回收1%琼脂糖凝胶电泳的大片段。

(4)退火片段的稀释与pGenesil1.2线性化质粒载体的连接:

反应条件如下:

试剂体积(μl)

无菌ddH2O5

10×buffer1

线性化pGenesil-1.21

稀释退火片段2

T4DNA连接酶1

16℃水浴连接过夜

(5)转化

  从-80℃中取出分质粒和DH5α感受态菌,冰上慢慢融化→约30min吸取100µg质粒加到200ul的DH5α感受态菌,轻轻旋转混匀→冰上30min42℃水浴箱,90s→冰上迅速冷却3-5min→加入37℃预热的1ml液体LB培养基37℃摇菌→150rpm×60min室温离心4000g×3min,沉淀细菌→倒去大部分上清,将剩余的少量液体和细菌沉淀吹打成悬液→将悬液全部转到90mm的LB平皿(含Kana抗生素),涂布均匀→正置LB平皿于37℃孵箱中20-30min,液体被吸收后,倒置平皿,培养12h。

1.2.1.2载体鉴定

(1)质粒小量抽提

  细菌培养物5ml室温离心→12,000g×1min弃上清,加入250µlsolutionⅠ,振荡至完全悬浮→加入250µlsolutionⅡ,温和颠倒10次混匀室温静置→4min加入350µlsolutionⅢ,立即温和颠倒10次室温离心→13,000g×5min将上清液吸入另一干净EP管中室温离心→13,000g×5min将上清液小心吸入吸附柱中室温离心→10,000g×1min弃管内液体,在吸附柱中加入BufferHB500µl室温离心→10,000g×1min弃管内液体,在吸附柱中加入700µlwashBuffer室温离心→10,000g×1min弃管内液体室温离心→13,000g×2min吸附柱放在1.5mlEP管中,加入60µlElutionBuffer,室温静置4min室温离心→13,000g×2min用紫外分光光度计快速测定质粒浓度,于-20℃保存。

(2)质粒酶切鉴定用SacI酶切重组质粒进行鉴定。反应体系如下:试剂 体积 重组质粒 1μg10×LBuffer2μlSacI1μl无菌dH2O 补足至20μl 3h37℃水浴酶切后,用1%琼脂糖凝胶进行电泳。将鉴定为正确的重组质粒分别命名为:pGenesil-JAZF1-1,pGenesil-JAZF1-2,pGenesil-JAZF1-3。

1.2.2重组质粒筛选鉴定

1.2.2.1细胞培养

(1)细胞复苏

  将细胞冻存管从液氮罐中快速取出,于37℃水浴中快速晃动使其中冻存液融化,在超净台中将细胞移至加有适量培养基(约1ml)的离心管中,室温离心800rpm×5min,弃上清,用新鲜培养基重悬细胞,即可对细胞进行常规培养。

(2)Hepa1-6细胞常规培养及传代

  培养体系:DMEM培养基+10%灭活胎牛血清+1%双抗溶液。培养条件:37℃,5%CO2,饱和湿度的恒温培养箱中培养。细胞传代:常规传代换液,每2天换液,当细胞生长至80%~90%时,以3~4×104个/ml细胞浓度传代;选取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

(3)3T3-L1细胞常规培养及传代

  在37℃,5%CO2条件下,使用含10%小牛血清的DMEM培养基(含双抗)培养细胞,当细胞生长至70%左右即可进行细胞传代,2天左右以1:3传代。

(4)3T3-L1细胞诱导分化

  将3T3-L1细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用含10%小牛血清的DMEM培养基培养细胞至生长融合→接触生长抑制48h(0天)→诱导分化液培养48h(2天)→进展维持液继续培养48h(4天)→更换为维持培养基,约2天换液→至90%以上前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞即可用于实验(约第10天左右),于倒置显微镜下观察,细胞变圆滑并形成大量脂肪滴。

(5)细胞冻存

当细胞生长至80%~90%时,收集细胞悬液,室温离心800g×5min,弃上清后加入1ml冻存液,重悬沉淀制成浓度为1~5×106个/ml的细胞悬液,转移至灭菌的冻存管内,4℃静置30min;-20℃,2h;-80℃,12h;快速转入液氮灌中长期冻存。

1.2.2.2细胞转染

  参照Lipofectamine2000说明书中转染步骤,方法如下:

(1)收集对数生长期细胞并计数,转染前用无血清DMEM培养基调整细胞浓度为5×105–1.25×106/ml,接种于6孔培养板中,总体积为1ml。

(2)溶液A:取5µg质粒DNA(空白对照组为PBS,阴性对照组为pGenesil-HK质粒,实验组分别为pGenesil-JAZF1-1,2,3质粒)+OPTI-MEM(总体积100µl),配制好后静置5min;溶液B:2.5µlLipofectamine2000+97.5µlOPTI-MEM。

(3)将溶液B加到溶液A中,混匀后在超净台中室温静置20min。

(4)将混合液逐滴加入准备好的6孔培养板中,轻轻摇动培养板,混匀。将细胞培养板置于细胞培养箱中孵育约4-6h。

(5)更换为含10%Gibco胎牛血清的DMEM培养基,继续放置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.2.2.3稳定细胞株筛选

  细胞转染24h后,使用含G418(终浓度1μg/m1)的DMEM培养基筛选阳性细胞。通过有限稀释法筛选获取获得稳定转染的单克隆抗性细胞,扩大培养,进行后续实验。

1.2.2.4提取细胞总RNA

  收集细胞于EP管中,PBS洗涤2次,每管加入0.8ml的Trizol试剂剧烈振荡→冰上裂解10min加入0.16ml氯仿,颠倒混匀后冰上静置5min4℃离心→12000g×15min吸上清至另一干净EP管中,加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,冰上静置约20min4℃离心→12000g×10min弃上清,向沉淀中加入75%乙醇RNase-freeH2O清洗沉淀4℃离心→12000g×5min弃上清,冰上干燥5min,加入适量的RNasefreeH2O溶解沉淀→用紫外分光光度计快速测量RNA浓度及纯度→用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析总RNA的完整性。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)