关键词:Westernblotting Qualitativeopticalway 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2实验方法

1.2.1细胞复苏

1)从液氮罐中取出细胞株,放置于37℃水浴箱中融化,动作轻柔,避免被水箱中的水污染。

2)将完全融化后的冻存液用巴氏吸管吸出移至含有全培的离心管中。

3)900rpm/4min,37℃条件下离心,离心完成时可见离心管底端有少量细胞沉淀。

4)用巴氏管吸出上清液,弃之,补充完全培养基4ml,巴氏管轻轻吹打,使细胞重悬。

5)将重悬了的细胞悬液至于事先已加入了完全培养基(6ml)的10cm细胞培养皿中。

6)“井”字形轻轻晃匀,置于显微镜下观察是否吹打均匀。

7)最后将10cm细胞培养皿放置于5%CO2,37℃的细胞孵箱中培养。

1.2.2细胞培养

1)从孵箱取出细胞培养皿,置于显微镜下观察细胞形态和生长密度,判断其生长状态,是否污染,确定是否需要传代。

2)用75%酒精消毒后,将完全培养基和胰蛋白酶放入孵箱中预热至37℃,PBS置于常温。

3)用75%医用酒精擦拭生物安全柜,放入所需实验器材后,紫外常规照射30min。

4)用巴氏管吸出细胞培养皿中的旧培养液(黄色),弃之,用巴氏管吸取3mlPBS轻轻吹打细胞表面,洗净后弃掉PBS,洗2次。

5)加入2ml胰蛋白酶消化细胞,并将细胞培养皿置于37℃孵箱中,维持蛋白酶的最适温度。

6)用巴氏管吸出胰蛋白酶,加入3ml完全培养基,用巴氏管吹打细胞培养皿,使细胞离开培养皿表面。

7)将细胞悬液至于离心管中,900rpm/4min,37℃条件下离心,离心完成时可见离心管底端有少量细胞沉淀。

8)用巴氏管吸出离心管中上清液,弃之,加入4ml完全培养基重悬细胞。

9)用巴氏管将细胞悬液均分(2ml)各自加入两个细胞培养皿中(事先加入全培8ml/皿)。

10)“井”字形轻轻晃匀,置于显微镜下观察是否吹打均匀。

11)最后将10cm细胞培养皿放置于5%CO2,37℃的细胞孵箱中培养。

1.2.3细胞蛋白质提取

根据贝博总蛋白提取试剂盒说明书操作,具体如下:

1)蛋白提取液制备:每1ml冷的总蛋白提取液中加入4μl磷酸酶抑制剂和4μl蛋白酶抑制剂,用1ml加样枪吹打混匀,置于冰上备用。

2)用1ml加样枪吸取细胞培养皿表面的培养基,弃之。

3)用PBS洗涤细胞培养皿2次,每次洗涤后用1ml加样枪尽量吸尽PBS。

4)加入适量冷的总蛋白提取液,震荡5分钟,并与细胞刮刀挂下,并用加样枪吸入移至另一干净2ml的EP管中。

5)在13300rpm、4℃条件下,离心20min。

6)将上清吸入另一干净的1.5ml的EP管中,即得到总蛋白。

7)将上述细胞蛋白原液用BCA蛋白定量试剂盒定量后分装于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.4组织蛋白质提取

根据贝博总蛋白提取试剂盒说明书操作,具体如下:

1)蛋白提取液制备:每1ml冷的总蛋白提取液中加入4μl磷酸酶抑制剂和4μl蛋白酶抑制剂,用1ml加样枪吹打混匀,置于冰上备用。

2)取0.08g(用电子称)组织样本入2ml的EP管中,用眼科剪剪碎,加入预冷的1ml总蛋白提取液,并用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。

3)在13300rpm、4℃条件下,离心20min。

4)将上清吸入另一干净的1.5ml的EP管中,即得到总蛋白。

5)将上述组织蛋白原液用BCA蛋白定量试剂盒定量后分装于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.5蛋白质定量

根据碧云天BCA蛋白浓度定量试剂盒额说明书进行操作,具体步骤如下:

1)取适量25mg/ml蛋白标准品,用PBS稀释至最终浓度0.5mg/ml。

2)根据样品数量,将BCA试剂A与BCA试剂B按50:1的比例,配置适量BCA工

作液,充分混匀后置于冰上备用。

3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板中,再加PBS补足到20μl。

4)加2μl体积待测样品至96孔板中,加PBS18μl补足。

5)每个孔均加200μlBCA工作液,37℃孵箱中放置30min。

6)用酶标仪测定波长=562nm时各孔的吸光度。

7)根据标准曲线和使用待测样品的体积计算出待测样品的蛋白浓度。

1.2.6蛋白质印迹试验

配置电泳凝胶:

1)分离胶(两块):

ddH2O8.0ml

PH8.8Tris5.0ml

30%Acr-Bis(29:1)6.6ml

10%SDS200μl

10%AP200μl

TEMED8μl

2)浓缩胶(两块):

ddH2O6.8ml

PH6.8Tris1.26ml

30%Acr-Bis(29:1)1.66ml

10%SDS100μl

10%AP100μl

TEMED10μl

电泳:

1)将已定量的蛋白样品(每孔40μg)与5×loading缓冲液以4:1的比例混合,98.5℃持续5min后放置于室温冷却。

2)蛋白预染marker不加热,放置于冰上待用。

3)取出两块已事先配置好的电泳凝胶,放入电泳卡槽中,夹紧。倒入事先配置好的电泳液。

4)将混有loadingbuffer的上样液震荡,瞬时离心,上样,开启电源,跑电泳。

5)电泳条件:恒压90V,90min,37℃,若溴酚蓝没有跑到胶的尽头,可以适当增加时间。

转膜(湿法转膜):

1)配制1×电转液(10×电转液:ddH2O:甲醇=1:7:2),放置于4℃冰箱中预冷。

2)在操作盘中倒入电转液,放入带孔夹板,白色滤纸,黑色海绵。

3)弃掉浑浊的电泳液,用Bio-rad塑料薄片撬开胶板,根据转膜时的需要切胶。

4)剪切下合适大小的0.45PVDF膜,用甲醇浸泡30秒。

5)制作“三明治”:黑色-黑孔板-黑色海绵-白色滤纸-凝胶-PVDF膜-白色滤纸黑色海绵-透明孔板-红色。

6)放入电转盒中,电转盒埋入冰盒中,开启电源,转膜。

7)转膜条件:恒压90V,60min,4℃,电源为Bio-radUniversal。抗体孵育:

1)配制封闭液,5%牛奶,2g奶粉+40mlTBST。

2)用配好的封闭液封闭PVDF膜,37℃,摇床(轻摇或静置),1小时。

3)配制一抗,抗体:TBST=1:1000。

4)将一抗、PVDF膜置于抗体孵育盒中,4℃,摇床(轻摇或静置),过夜。

5)配制二抗,抗体:5%牛奶=1:5000。

6)回收一抗,用TBST洗涤PVDF膜,摇床轻摇,洗3次,每次10min。

7)将二抗、PVDF膜置于抗体孵育盒中,37℃,摇床(轻摇或静置),1小时。

8)弃去二抗,用TBST洗涤PVDF膜,摇床轻摇,洗3次,每次10min。ECL显影:

1)将碧云天ECL试剂盒中的A液和B液等体积混合(0.85ml+0.85ml)。

2)用镊子夹出PVDF膜,放置于培养皿盖子上,加入事先配好的ECL工作液,约1min后,放置于凝胶成像仪上,照像并将所得的结果保存。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)