关键词:ADAMTS18 乳腺癌 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2实验方法

1.2.1准备蛋白样品

1.弃掉细胞培养瓶中的培养液,用预冷PBS洗2次,将培养瓶中残余液体甩干。2.按RIPA:PMSF:cocktail100:1:1的比例配制蛋白裂解液,混匀后,每个培养瓶加入150μl裂解液,晃动培养瓶,使裂解液充分覆盖培养瓶中细胞。将培养瓶放到4℃冻库中摇床上摇晃5min。3.用清洁好的细胞刮将培养瓶中细胞刮下来,转移至EP管中,vortex振荡30s后,用超声仪超声15次。4.超速低温离心机离心,4℃12000g×10min,EP管底部有沉淀产生,吸上清转移至新的EP管中,弃沉淀。保存于-80℃备用。

1.2.3SDS-PAGE电泳

1.将蛋白电泳仪器安装好,加入三蒸水,观察是否密闭不漏水,若漏水需重新安装。2.配制10%分离胶:(15ml)10%分离胶ml

三蒸水5.9

30%Acrylamide5

1.5MTris-HCl(PH8.8)3.8

10%SDS0.15

10%过硫酸铵0.15

TEMED0.006

3.将分离胶混匀后加入玻璃夹板中,加后加入无水乙醇1ml压线,室温放置15-30min,分离胶凝固后,倒掉表面的无水乙醇。4.配制5%浓缩胶:(10ml)5%浓缩胶ml

三蒸水6.8

30%Acrylamide1.7

1.5MTris-HCl(PH6.8)1.25

10%SDS0.1

10%过硫酸铵0.1

TEMED0.01

5.将浓缩胶混匀后,加入玻璃夹中,并迅速插上梳齿。5-10min后,浓缩胶凝固。6.将玻璃夹板取出,组装到电泳槽中,加入电泳液,取出梳齿。7.依次向梳齿形成孔中加入蛋白marker和事先准备好的待测蛋白样品(40μg),先用60V电压电泳至浓缩胶和分离胶交界处,将电压换成100V继续电泳至蛋白marker和蛋白样品不同条带分离开后,停止电泳。

1.2.4转膜、封闭、孵抗体、显影

1.用无水乙醇将PVDF膜浸泡2min,目的是将PVDF膜激活,然后将PVDF膜取出放到三蒸不中浸泡备用。2.将玻璃夹板中的SDS-PAGE胶取出,放至转膜架中,其上按所需蛋白条带位置放上PVDF膜(黑胶白膜),赶走胶与膜之间的气泡,夹好转膜架。3.将组装好的转膜架放入电泳槽中,100V转膜100min。4.转膜完成后,取出PVDF膜,其上可见蛋白marker。5.将PVDF膜取出,放到含5%脱脂牛奶的TBST溶液中封闭1小时,封闭完成后取出PVDF膜,用TBST溶液稍清洗。6.孵一抗:将PVDF膜放入稀释好的一抗中,放到4℃冻库孵育过夜。7.取出PVDF膜,用TBST清洗三次,每次10min,去除一抗。8.将PVDF膜放入5%脱脂牛奶的TBST稀释好的二抗中,孵育1小时。9.取出PVDF膜,用TBST清洗4次,每次15min,去除二抗。10.配制显色工作液:按1:1比例混合过氧化酶溶液和ECL试剂中的增强液。将显色工作液滴加到PVDF膜上,用Las-4000ImagingSystem成像。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)