关键词:ADAMTS18 人乳腺癌细胞株 乳腺组织 甲基化 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2实验方法

1.2.1组织DNA提取

  具体实验步骤如下:1.将冻存于-80℃冰箱中的装有组织标本的冻存管转移至小型液氮罐中。2.将冻存管中的组织标本在液氮罐中充分研磨,转移至无酶EP管中,待液氮挥发后,加入600μlTENS和12μl蛋白酶K。3.55℃孵育24h,直至组织完全裂解,期间振荡几次。4.冷却至室温,加入6M饱合NaCl170μl,振荡15s。5.4℃低温离心机离心,12000g×10min。6.转移上清至新的无酶EP管,加入异丙醇600μl,上下颠倒混匀至有新的絮状物析出。7.4℃低温离心机离心,4000g×5min,弃上清。8.加入70%乙醇800μl,清洗杂质两次,4℃低温离心机离心,4000g×5min。9.弃上清,干燥DNA,根据DNA多少添加TEbuffer20-200μl,溶解后测浓度,-80℃冰箱保存。

1.2.2DNA重亚硫酸盐修饰

具体实验步骤如下:按EZDNAmethylation-GoldKit试剂盒进行操作。制备CTConversionReagent,体系如下:

M-DilutionBuffer300μl

M-DissolvingBuffer500μl

DEPC水900μl

室温下溶解并震荡10min。用亚硫酸氢盐处理DNA:1.24ml100%乙醇加入到M-WashBuffer中备用。2.取DNA20μl(0.2-0.5ug)加入到配制好的CTConversionReagent130μl。3.将混合液放入恒温器中:98℃,10min;64℃,2.5h;4℃,20h;4.将混合液加入离心柱,后加入600μlM-BindingBuffer,颠倒几次混匀后,离心:12000rpm×30s,去除流出液;5.加200μlM-WashBuffer,离心:12000rpm×30s;6.加200μlM-DesulphonationBuffer,室温下放置20min,离心:12000rpm×30s;7.加200μlM-WashBuffer,离心:12000rpm×30s;重复一次;8.将柱子移入新的EP管内,加10μlM-ElutionBuffer到柱基质中,12000rpm离心30s。9.所得DNA分装后保存于-20℃备用。

1.2.3去甲基化药物(Aza+TSA)处理

  具体步骤如下:1.培养瓶中细胞覆盖瓶底约30-40%时,弃掉陈旧培养液,用PBS洗两次后,加入含有Aza(10mmol/L)的新鲜培养液,培养72h(若中途需换液,继续用含Aza的培养液)。2.72h后,弃掉含Aza的培养液,用PBS洗两次后,加入含TSA的培养液,TSA终浓度为100nmol/L,继续培养24h。3.处理共96h后,按第一部分所述方法提RNA。处理过程中,若细胞融合度达到80-90%时则传代处理,用没有经Aza+TSA处理的细胞作对照。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)