关键词:ADAMTS18 人乳腺癌细胞株 乳腺组织 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2.2RNA提取

操作步骤:1.细胞RNA提取:倒掉培养瓶中的RPMI1640或DMEM/F12培养液,用PBS洗两次后,吸干培养瓶内的残余液体。在通风橱内加入1mlTrizol试剂,放入4℃摇床中慢摇5min,使试剂完全覆盖细胞表面并与其充分接触。用无酶枪头反复吹打,让细胞从瓶壁脱落和充分裂解。将上述充分裂解后的混合细胞液移入无酶EP管中。组织RNA提取:将冻存于-80℃冰箱中的装有组织标本的冻存管转移至小型液氮罐中。取出冻存管,将组织在液氮中充分研磨,直到研碎后,倒入EP管中。待液氮挥发后加入1mlTrizol试剂,让组织与Trizol充分混匀,溶解。

2.每毫升混合液中加入200μl氯仿,剧烈震荡,充分混匀后,冰上静置3min。4℃低温离心机中,12000g离心15min后,可见EP管中液体分为三层。3.用无酶枪头将上层透明液相轻轻移入新的EP管中,加入与液相等体积的异丙醇,充分混匀后,静置10min。4.4℃低温离心机中,12000g离心15min后底部有白色沉淀析出。5.弃上清,用负压吸引器将EP管中液体吸干,加入1ml75%乙醇,充分混匀,洗涤沉淀。6.4℃低温离心机中,7500g离心5min后底部有白色沉淀析出。7.弃上清,用负压吸引器将EP管中残余液体吸干,让所得RNA干燥中。8.根据沉淀多少,加入不同体积(10-50μl)DEPC水。混匀后测浓度,备用,不用时放于-80℃冰箱中保存。

1.2.3RT-PCR(逆转录PCR)

步骤如下:一、RNA逆转为cDNA反应体系为20μl,具体步骤如下:RNA1μgOligo(dT)1μlDEPC至5μl混匀后,PCR仪上机,70℃5min,取出置冰上放置5min后,加入下面混合液:

Buffer4μl

MgCl22μl

dNTP1μl

RNase1μl

RNaseinhibitor0.5μl

DEPC至15μl

混匀后,PCR仪上机,程序如下25℃5min42℃1h70℃15min反应完成后,取出cDNA。二、PCR反应体系为10μl,具体步骤如下:

5xGo-Taqbuffer1.6μl

MgCl2(25μM)0.4μl

5’primer(10μM)0.6μl

3’primer(10μM)0.6μl

Go-Taq0.05μl

cDNA2μl

DEPC4.75μl

混匀后,PCR仪上机,反应程序如下:

95℃2min

内参23个循环目的32个循环

95℃30s

55℃30s

72℃30s

95℃3min

三、凝胶电泳及成像具体步骤如下:1.准备凝胶灌制平板,将梳齿插入其中。2.配制2%的琼脂糖凝胶:用电子称称取合适剂量的琼脂糖粉末,加入1xTAE溶液中,摇匀后放入微波炉中高火加热约2min,直到取出时液体变为清亮。3.按TAE与SYBRsafe20:1的比例用移液枪加入SYBRsafe,混匀倒入事先准备好的凝胶灌制板中。待其自然冷却。4.凝胶凝固后,轻轻取出梳齿,将平板和凝胶一起放入装有1xTAE的电泳槽中。5.上样:依次加入marker和样本。6.正确接上电极,电压120V,电泳25min。7.结束后,取出凝胶于凝胶成像系统中曝光,分析观察结果。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)