关键词:EdU细胞增殖实验 DIMT1 胃癌细胞 恶性生物学行为 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR  白鲨易 biosharp

 

(1)48孔板每孔内添加完全培养基500μl及青-链霉素溶液5μl,振荡混匀,按照细胞传代方法收集对数生长期细胞,接种5×103个细胞于48孔板内,加入细胞后水平“十字”晃动48孔板20次,使细胞均匀分布;

(2)37℃,5%CO2培养至细胞贴壁,按照EdU试剂盒说明书用完全培养基将A试剂制备成浓度为25μM的EdU培养基;

(3)移除培养基,PBS洗涤2次,每孔添加EdU培养基200μl,37℃,5%CO2继续孵育(不同细胞具体孵育时间参照EdU试剂盒说明书);

(4)移除EdU培养基,PBS洗涤5min×3次,脱色摇床进行;

(5)每孔添加4%多聚甲醛溶液,室温孵育30min,弃多聚甲醛,每孔添加2mg/ml甘氨酸溶液,脱色摇床洗涤5min;

(6)移除甘氨酸溶液,PBS洗涤5min,脱色摇床进行;

(7)每孔添加0.5%TritonX-100渗透剂200μl,脱色摇床孵育10min,弃渗透剂,PBS洗涤5min×2次,脱色摇床进行;

(8)按照EdU试剂盒说明书配置1×Apollo染色反应液,现配现用,具体配方如下:

试剂名称体积或质量

ddH2O938μl

试剂B50μl

试剂C10μl

试剂D2μl

试剂E10mg

总体积1000μl

(9)每孔加入100μl1×Apollo染色反应液,避光、室温,脱色摇床孵育30min;

(10)弃反应液,每孔添加0.5%TritonX-100渗透剂200μl,避光,脱色摇床洗涤10min×3次,弃渗透剂,每孔加入甲醇溶液200μl,脱色摇床清洗5min×2次;

(11)弃甲醇溶液,PBS洗涤5min,避光脱色摇床进行;

(12)按照试剂盒说明书使用ddH2O按1:100比例制备1×试剂F,避光配置,每孔加入100μl试剂F,避光、室温脱色摇床孵育30min;

(13)弃试剂F,PBS洗涤5min×3次,避光脱色摇床进行;

(14)荧光显微镜下采集图像,每孔采取4个视野,每个视野均采集EdU红色荧光和试剂F蓝色荧光,再将红色荧光和蓝色荧光Merge到一张图片;

(15)使用ImageJ图像处理软件对EdU阳性细胞和试剂F阳性细胞进行计数,EdU阳性率=EdU阳性细胞/试剂F阳性细胞;使用SPSS22.0进行统计分析,p<0.05提示有统计学意义,最后使用GraphPad软件进行作图。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)