关键词:免疫荧光 DIMT1 胃癌细胞 恶性生物学行为 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR  白鲨易 biosharp

 

(1)于24孔板内放置无菌方形玻璃片,每孔添加1ml完全培养基及10μl青链霉素混合液(24孔板培养细胞容易被污染,故提高抗生素浓度),振荡混匀,每孔加入细胞1×105,加入细胞后水平“十字”晃动24孔板20次,使细胞均匀分布;

(2)将24孔板置入恒温孵育箱,37℃,5%CO2培养48h,观察细胞汇合度达到70%左右后停止培养,开始行免疫荧光实验;

(3)移除培养基,加入预冷PBS溶液,脱色摇床振荡洗涤10min,重复3次,弃PBS溶液;

(4)4%多聚甲醛溶液固定细胞30min,弃多聚甲醛,加PBS溶液,脱色摇床振荡洗涤10min,重复3次,弃PBS溶液。

(5)0.5%的TritonX-100孵育10min,室温进行,弃TritonX-100,加入PBS溶液,脱色摇床振荡洗涤10min,重复3次,弃PBS溶液(如果目标蛋白主要在细胞膜上表达则不需要进行该步骤,TritonX-100会破坏细胞膜,导致实验失败);

(6)5%的山羊血清封闭60min,室温进行,弃山羊血清,每孔内加入200μl一抗稀释液(免疫荧光对抗体浓度要求较高,一般按照说明书推荐稀释比例提高1倍稀释比较适宜);

(7)使用保鲜膜包裹密封24孔板(避免抗体稀释液蒸发导致干片),将24孔板置入4℃冰箱孵育过夜(孵育时间一般为18h),回收一抗稀释液后加入PBS,脱色摇床振荡洗涤10min(增加脱色摇床振荡频率及强度,尽量去除未与抗原结合的一抗),重复3次,弃PBS溶液;

(8)每孔内加入200μl荧光二抗稀释液(避光配置荧光二抗稀释液),锡箔纸包裹24孔板,37℃恒温孵育箱避光孵育60min(以下操作步骤均避光进行);

(9)弃荧光二抗稀释液,加入PBS,脱色摇床避光振荡洗涤10min(增加脱色摇床频率,去除未与一抗结合的荧光二抗),重复3次,弃PBS溶液,每孔内加入200μlDIPA溶液,37℃恒温孵育箱避光孵育10min;

(10)弃DIPA溶液,加入PBS,脱色摇床避光振荡洗涤10min,重复3次,弃PBS溶液,载玻片上滴加20μl抗荧光淬灭剂,将玻片细胞面倒扣于载玻片上;

(11)荧光共聚焦显微镜下采集图像,每孔采取4个视野,每个视野均采集红色荧光(目标蛋白)和蓝色荧光(细胞核DIPA染色),再将红色荧光和蓝色荧光Merge成一张图片,并对荧光强度进行测量分析。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)