关键词:氧化型ATM蛋白激酶 乳腺癌 CAFs 细胞自噬 乳腺癌细胞侵袭 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa

 

1.5.1Labelfree磷酸化蛋白质组学检测

(1)细胞样本准备:常规培养NFs和CAFs细胞,当细胞生长至融合度达到约80%时,NFs仍常规培养(21%O2、5%CO2),CAFs低氧培养6h(1%O2、5%CO2)。弃去细胞上清,用预冷的PBS缓冲液清洗3次,再用预冷的SDT裂解缓冲液裂解细胞,将收集好的细胞裂解产物进行液氮速冻,干冰运输至上海中科新生命生物科技有限公司检测。

(2)严格按照检测流程进行样本的预处理、检测和分析,大致步骤为:细胞蛋白裂解、蛋白定量、蛋白质的FASP酶解、肽段脱盐、肽段定量检测、酸化肽段富集、酶解产物的LCMS/MS分析和Maxquant的非标记分析等。

1.5.3细胞荧光检测(Immunofluorescence,IF)

(1)细胞准备:在24孔板中放置洁净的玻璃爬片,在爬片上接种细胞,使其尽量以单个细胞生长,细胞贴壁后施加低氧或抑制剂处理。

(2)固定:弃去上清,用预冷的PBS缓冲液在摇床上清洗细胞3次,每次5min,加入4%多聚甲醛室温固定20min,甩干。

(3)透膜:用预冷的PBS缓冲液在摇床上清洗细胞3次,每次5min,加入0.1%Triton透膜15min,甩干。

(4)封闭:用预冷的PBS缓冲液在摇床上清洗细胞3次,每次5min,加入10%左右的山羊血清室温封闭30min,甩干。

(5)抗体孵育:在细胞爬片上滴加用一抗稀释液稀释(按照抗体使用说明书推荐比例稀释)的一抗4°C孵育过夜,用预冷的PBS缓冲液在摇床上清洗细胞3次,每次5min。暗室避光条件下在爬片上滴加用山羊血清稀释(一般为1:200)的荧光二抗37°C水浴孵育1h,用预冷的PBS缓冲液在摇床上清洗细胞3次,每次5min。

(6)DAPI染色:暗室避光条件下在爬片上滴加用PBS稀释成的1×DAPI染色液染色5min,用预冷的PBS缓冲液在摇床上清洗细胞3次,每次5min。

(7)封片观察:暗室避光条件下在载玻片上滴加100%甘油,将细胞爬片反盖在载玻片上进行甘油封片,在正置荧光显微镜下观察目的荧光。

1.5.4透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)观察自噬体

(1)细胞样品准备:接种细胞,常规培养,当细胞生长至融合度达到约80%时施加处理因素,需要保证收集细胞时细胞量达到106以上。

(2)样本离心预处理:用0.25%胰蛋白酶溶液消化收集细胞,先将细胞消化液装入10ml离心管,以800rpm/min、5min离心,离心管底部将形成松散的细胞团块。吸去上清液,保留1.5ml左右细胞液体,再将细胞团块吹散,均匀分布于细胞液中。

(3)样本固定:将细胞液装入1.5mlEP管中,以1200rpm/min、10min离心,EP管底部将形成细胞团块。吸净上清液,沿管壁缓慢加入固定液戊二醛,切勿破坏细胞团块。

(4)电镜观察:将固定好的细胞样本置于4°C冰箱保存,并尽快送往电镜室,透射电子显微镜观察自噬体的形成。

1.5.5细胞免疫共沉淀实验(CO-immunoprecipitation,CO-IP)

(1)细胞样本准备:接种细胞,常规培养,当细胞生长至融合度达到约80%时施加低氧或抑制剂等处理因素。处理结束弃去培养基,用预冷的PBS缓冲液清洗细胞3次,用细胞刮子刮下细胞,以4°C、2000rpm、10min离心,弃去上清液,加入含1%PMSF的结合缓冲液(IP裂解液)400μL,混匀后冰上裂解10min。以4°C、14000g、10min离心收集上清液,置于-20°C保存备用。

(2)磁珠预处理:将磁珠涡旋震荡1min使其充分重悬均匀后取30μL于1.5mlEP管中,加入200μL结合缓冲液洗涤,用磁力架进行磁性分离,弃去上清液,再重复洗涤一次后加入200μL结合缓冲液重悬备用。

(3)磁珠-抗体复合物制备:用结合缓冲液稀释抗体(稀释比例参照抗体说明书)得到抗体工作液,把重悬后的磁珠行磁性分离后弃去上清,加入200μL抗体工作液,迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪上轻轻翻转EP管,15min后行磁性分离,弃去上清液,加入200μL结合缓冲液洗涤,用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散,行磁性分离,弃去上清液,重复洗涤一次。

(4)抗原沉淀反应:加入200μL制备好的抗原样品,用移液器轻轻吹打,使抗原与磁珠-抗体复合物均匀分散,置于翻转混合仪上轻轻翻转4°C孵育过夜。行磁性分离,弃去上清液,加入200μL洗涤缓冲液,用移液器轻轻吹打使其均匀分散,行磁性分离,弃去上清液,再重复洗涤两次。最后加入200μL洗涤缓冲液,转移至新的EP管中,行磁性分离,弃去上清液。

(5)抗原洗脱:加入30μL2×SDS-PAGE上样缓冲液loadingbuffer,混合均匀,100°C加热5min,行磁性分离,收集上清液行SDS-PAGE检测目的蛋白。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)