关键词:高脂饮食 小鼠 脂肪组织炎症 胰岛素敏感性 CD36棕榈酰化 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa 

 

1.2方法

1.2.1小鼠GTT、ITT试验

GTT试验:小鼠禁食12小时后称重,腹腔内注射葡萄糖工作液(0.1mL/10g),分别于0min、15min、30min、60min及120min抽取小鼠尾静脉血检测血糖值。

ITT试验:小鼠禁食4h后称重,根据小鼠体重(每10g体重注射0.1mL葡萄糖工作液)腹腔内注射胰岛素工作液,分别于0min、15min、30min、60min及120min抽取小鼠尾静脉血检测血糖值。

1.2.2组织标本收集

  经腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠(10g/0.1ml)后,四肢固定于操作台上。用眼科剪在小鼠腹部开口后,逐层分离小鼠腹腔及胸腔筋膜、肌肉以及皮下组织,完整暴露小鼠胸腹腔后,注射器从小鼠右心室抽血,存放于1.5ml高压消毒后EP管内,静止离心后去上清于-80℃保存。继续解剖小鼠,依次将小鼠肝脏、肾脏、近肠、远肠、肌肉、附睾脂肪等取出,根据需要分装于ER管内,放于-80℃保存。

1.2.3脂肪组织CD36棕榈酰化检测

(1)取脂肪组织100mg放入匀浆机,70HZ,匀浆20s。

(2)取出磁珠,每个EP管内加入LB+NEM(50)1ml,4°旋转混合30min

(3)预冷离心机后,将EP管放入,4°12000转10min,离心后取上清加入新EP管

(4)每管加入5ulproteinG磁珠,4°旋转混合预处理30min

(5)30分钟后将EP管放置于磁力架上,吸去proteinG磁珠,每管液体中加CD36抗体20ul,4°旋转混合过夜

(6)取下EP管,每管加入50ulproteinG磁珠,室温旋转混合2h

(7)将EP管放于磁力架上,弃上清,每管加入600ulLB+NEM(10mM)重悬proteinG磁珠,取200ul混悬液到-HAM组,400ul到+HAM组,再用LB+NEM(10mM)分别标化每管到500ul,冰上孵育10min

(8)用0.5mlstrigentbuffer将每个EP管内磁珠迅速洗3次后,向+HAM组加入0.5mlHAMbuffer,-HAM组加入0.5mlPH7.2LB。室温旋转混合40min

(9)用0.5mlPH6.2LB洗涤proteinG磁珠后,将EP管放于冰上,每管加入0.5mlbiotin-BMCC,4°旋转混合40min

(10)(全程冰上)用0.5mlPH6.2LB洗涤proteinG磁珠1次,随后用PH7.2LB洗涤磁珠3次,将EP管放于磁力架上,弃上清,每管加入50ulloadingbuffer+5mMDTT煮10min

(11)将EP管放于磁力架上,去proteinG磁珠,蛋白放入-20°保存。具体

实验试剂配方如下:

chemicalreagent

2mlLB+NEM(50mM)

8mlLB+NEM(10mM)

6mlstrigentbuffer

loadingbuffer+5mMDTT

1.75mlLB+0.25mlNEM(储存液)

7.8mlLB+0.2mlNEM(储存液)

6ml(LB+NEM(10mM))+60ul10%SDS

1mlloadingbuffer+5ul1MDTT

1.2.4脂肪组织全蛋白提取

(1)称取脂肪组织100mg,放入1.5mlEP管,每管加入800mlLB后放入磁珠,用组织匀浆机70HZ研磨1min。LB试剂配方同上。

(2)研磨完毕后,取出磁珠,将EP管放于冰上共同放置于4℃振荡器上充分震荡20min,同时预冷离心机

(3)震荡完成后,取出EP管离心,4℃,12000rpm,20min

(4)取上清(约300-500ul),分装放入新的高压灭菌的1.5mLEP管内,每管约30-60ul,放入-80℃保存备用.

1.2.5Westernblotting

(1)提前将1.5mm玻璃板及齿梳洗好,在电泳槽内组装好后一起放入37℃恒温箱中烘干。

(2)由样本数确定SDS-PAGE制胶量,浓缩胶和分离胶具体配制比例如下:

8%分离胶(15ml):

ddH2O6.9mL

1.5MTris-HCl(pH8.8)4.0mL

10%SDS3.8mL

40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(39:1)0.15ml

TEMED0.15mL

10%过硫酸铵0.009mL

5%浓缩胶(8ml):

ddH2O5.5mL

1.5MTris-HCl(pH8.8)1.3mL

40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(39:1)1.0mL

10%SDS0.08mL

10%过硫酸铵0.08mL

TEMED0.008mL

(3)首先将上述分离胶混匀后加入两块玻璃板间隙内,每侧玻璃板内约加7ml,然后沿板壁缓慢加入2ml甲醇后,置于37℃恒温箱放置,18分钟

(4)弃上层无水乙醇(注意要吸干净),加入配好的浓缩胶,每侧约3ml,然后缓慢插入10道梳,保证孔内没有气泡后,放入37℃恒温箱15分钟

(5)待浓缩胶完全凝固之后,向电泳槽内加满1×电泳液,待电泳液溢出至外槽1/3高度即可,拔出梳子后可等待上样

(6)将蛋白样品取出放于室温解冻,震荡瞬离后同蛋白Maker一同上样

(7)电泳:80V恒压电泳约1小时后,改为110V至样品跑出胶结束

(8)切胶及备膜:取出玻璃板,根据Maker标记,找到目的蛋白后,将凝胶块切下待用。PVDF膜裁剪后按顺序放入甲醇、双蒸水、转膜液中备用

(9)电转:在电转夹中按如下顺序放置(从黑色阴极面开始):纤维素垫、1张厚滤纸、胶、PVDF膜、1张厚滤纸、纤维素垫(注意记住膜的正反面),用胶棒排出气泡后,夹紧电转夹放入放入电转槽内,加入电转液,调节电流250mA恒流电转1-2.5小时

(10)封闭:电转完后,取出PVDF膜放入孵育盒内(孵育盒提前洗好烤干备用),盒内加5ml0.2%BSA,放于4℃温摇床过夜

(11)一抗:用0.2%BSA稀释一抗,按照actin1:2000,JNK1:200,CD361:2000,NF-KB1:1000,AKT1:800,IRS-11:1000,P-AKT1:200,P-IRS11:200,TLR41:500比例稀释,然后将膜和稀释后的一抗一起放入孵育盒内(孵育盒提前洗好烤干备用),37℃恒温振摇2小时

(12)二抗:PVDF膜加TBST液洗膜,3次,每次8min。用TBST按照1:10000比例稀释二抗,将洗好的膜与稀释后的二抗一起放入孵育盒内(孵育盒提前洗好烤干备用),37℃恒温振摇1小时

(13)PVDF膜用TBST液洗3次,每次10min,最后再用TBS洗膜一次,15min

(14)显色:将显色液中两种液体按说明书混在一起后,与显影前2min加在PVDF膜上,可用枪头反复吸取,放入化学成像系统,曝光约5s-1min,拍照保存

1.2.6脂肪组织HE染色

  在通风橱内,将脂肪组织石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ30分钟→二甲苯Ⅱ30分钟,然后再依次放入100%酒精10分钟→95%10分钟→85%10分钟→75%10分钟→50%乙醇10分钟→ddH2O10分钟×2次。将切片放入HE染液中5-15s终止染色,观察确定染上后,再复染核约1min。在显微镜下观察染色情况并拍照。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)