关键词:Ca2+ cAMP信号通路 云芝糖肽 黄芪多糖 免疫调节机制 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa

 

1.2方法

1.2.1小鼠巨噬细胞的培养

  小鼠巨噬细胞株-RAW--264.-7-细胞培养于-DMEM-高糖完全培养基

(DMEM:FBS:PS=90:10:1,单位ml)中,细胞培养条件是37℃、5%CO2。

1.2.2Griess法检测细胞内NO的浓度

  将RAW264.7细胞5×104/ml铺于24孔板,细胞贴壁后分别加入APS(终浓度25μg/ml),PSP(终浓度25μg/ml)和LPS(终浓度100ng/ml)共同孵育4h,8h,16h,24h,32h,48h,分别收集各时间点的细胞,收集的细胞用400μl的PBS重悬,然后-用超声破碎仪破碎细胞-,-然后-离心留取上清液-。

(1)-从低温保存的-4℃-冰箱中取出避光存放的-Griess--试剂--I--和--II-,-待缓慢平衡至室温后使用。。

(2)-RAW-264.-7-细胞是在-DMEM-高糖培养基中培养-,因此用-DMEM-高糖完全培养基稀释标准品,标准品的浓度梯度取-0-,-1-,-2-,-5-,-10-,-20-,-40-,-60-,-100-μM。

(3)取出一个新的96孔板,用记号笔分别标记好样品孔和标准品孔,向每孔中加入50μl标准品或样品。

(4)-先用移液器向上述孔中加入-50μl-的试剂-I-,-然后再加入试剂-II-。

(5)酶标仪在540nm测定吸光度。

(6)用CurveExpert1.3生成标准曲线,根据标曲线求得样本NO的浓度。

1.2.3ELISA法检测细胞内cAMP含量

将RAW细胞107/ml铺于6cm培养皿,细胞贴壁后分别加入APS和PSP共同孵育4h,8h,16h,24h,48h,收集的细胞用400μl的PBS重悬,然后-用超声破碎仪破碎细胞-,--离心留取上清液-。

(1)从-20℃冰箱中取出96孔酶标板、DetectionA、标准品、DetectionB,以及4℃冰箱中的其他试剂,待缓慢平衡至室温再使用。

(2)从96孔酶标板中取出需要的孔数,用记号笔分别在酶标板上标记好空白、样品和标准品,各孔的样品或者标准品加样量均为-50-μl-,-待加入-50-μl-Detection-A-后,-放入-37℃-孵箱中-60-min。

(3)用配制好的洗涤液洗板3次,然后用移液器向各孔中加入试剂DetectionB50μl,放入37℃孵箱中30min。

(4)洗涤液洗板-5-次后-,-用移液器向孔中加入-90-μl-的底物-,避光-20-min显色-。-待酶标板孔中有数孔颜色变黄时-,-加入终止液-。

(5)酶标仪在450nm测定吸光度。

(8)用CurveExpert1.3生成标准曲线,根据标曲线求得样本cAMP的浓度。

1.2.4ELISA法检测细胞内DAG,IP3含量

  将RAW细胞107/ml铺于6cm培养皿,细胞贴壁后分别加入APS和PSP共同孵育4h,8h,16h,24h,48h,收集的细胞用400μlPBS重悬,然后用超声破碎各时间点收集的细胞,经过4摄氏度离心机离心后,-不要-EP-管底的细胞沉渣-,-留取离心后的上清液-。

(1)从冰箱中取出试剂盒,待缓慢平衡至室温再使用。

(2)用记号笔分别在酶标板上标记好空白、样品和标准品,每个标准品浓度设置2个复孔,按照试剂盒说明手册稀释各浓度的标准品。

(3)样品孔中加入10μl样品和40μlSampleDiluent,混匀后封板放入37℃孵箱中0.5h。

(4)用配置好的洗涤液洗板-5-次,-然后向各反应孔中加入酶标记的试剂-。混匀后封板放入37℃孵箱中0.5h。

(5)用配置好的洗涤液洗板5次。用加样枪向孔中先加入50μlchromogenicagentA,然后再加入50μlchromogenicagentB,把酶标板放入37℃孵箱中15min。

(6)-终止-,-立刻放入酶标仪在-450-nm-测定吸光度-。

(7)用CurveExpert1.3生成标准曲线,根据标曲线求得样本DAG,IP3的浓度。

1.2.5光谱法检测细胞内PKC含量

  将RAW细胞107/ml铺于6cm培养皿,细胞贴壁后分别加入APS和PSP共同孵育4h,8h,16h,24h,48h。

(1)按照试剂盒说明书提取各样品样品中的总蛋白,并进行蛋白浓度定量。

(2)用记号笔分别在96孔板上标记好背景、样品孔,用加样枪向每孔中加入65μl的试剂C。

(3)用加样枪向96孔板上各孔中分别依次加入10μl试剂D、试剂E、试剂F。混匀后放入30℃孵箱中3min。

(4)向各孔中加入5μl试剂G或者50μg的样品蛋白裂解液。

(5)-混匀后放入酶标仪在-340-nm-测定吸光度-。

(6)-按照试剂盒说明书的公式计算-PKC-的活性-。

1.2.6尼康激光共聚焦检测细胞内[Ca2+]i

  将RAW细胞103/ml铺于共聚焦皿中,贴壁后24h再进行其他处理。

(1)先配置-Ca2+-探针-Fluo-4--AM-工作液-,-配制成-10-μmol/l-的浓度。

(2)吸去共聚焦皿中的DMEM完全培养基,用平衡盐清洗3遍后加入10μmol/l的工作液50μl,然后放入孵箱中45min。

(3)吸去钙离子探针工作液,用平衡盐清洗3遍后加入平衡盐50μl

(4)放入孵箱中25min。

(5)用尼康-TE2000--U激光共聚焦显微镜检测[Ca2+]i。(494/516nm)

(6)尼康-TE2000--U激光共聚焦显微镜实时检测细胞内钙离子荧光强度,先检测阴性对照中细胞内-Ca2+-的荧光值-(-只有-HBSS-平衡盐-),-然后分别加入-APS和PSP,观察药物对细胞内-Ca2+-的荧光值变化情况;-最后加入-NiCl2,观察NiCl2阻断Ca2+通道后细胞内钙荧光值的变化。

(7)用NIS-ElementsViewer4.20软件处理拍得照片。

1.2.7ELISA法检测巨噬细胞上清液中IL-6和TNF-α含量

  将-RAW-细胞-104/m-铺于-24-孔板中-,-贴壁后分别加入-APS-(-药物处理组-),-PSP-(-药物处理组-)-,-LPS(-阳性对照组-)-,-APS-和-NiCl2-(-Ca2+通道阻滞组-),-PSP-和-NiCl2-(-Ca2+-通道阻滞组-),-DMEM-培养基-(-阴性对照组-)处理-24h-后,收集培养液上清-。

-ELISA-法检测小鼠白细胞介素-6-(IL-6),-操作流程如下-:

(1)按照说明书配制好各种溶液。

(2)从冰箱中取出试剂盒,待各试剂缓慢恢复至室温再使用。

(3)用记号笔分别在酶标板上标记好空白、样品和标准品,按照试剂盒说明手册稀释各浓度的标准品。-用移液器向相应的孔中加入-100-μl-的稀释液-、-样品和标准品-。-温育-90-min-。(实验中孵箱温度是37摄氏度)

(4)用配置好的洗涤液洗板4次,然后用移液器加入100μl的生物素抗体,混匀放入孵箱中一个小时。

(5)用配置好的洗涤液洗板4次,然后用移液器加入100μl的酶结合物,混匀放入孵箱中半个小时。

(6)用配置好的洗涤液洗板4次,用加样枪向孔中先加入100μlchromogenicagent,把酶标板放入37℃孵箱中15min。

(7)-终止-,-立刻放入酶标仪在--450-nm--测定吸光度-。

(8)用CurveExpert1.3生成标准曲线,根据标曲线求得样本IL-6的浓度。

-ELISA-法检测小鼠肿瘤坏死因子--α(-TNF-α-),-操作流程如下-:

(1)按照说明书配制好各种溶液。

(2)从冰箱中取出试剂盒,待各试剂缓慢恢复至室温再使用。

(3)用记号笔分别在酶标板上标记好空白、样品和标准品,按照试剂盒说明手册稀释各浓度的标准品。用移液器向相应的孔中加入100μl的稀释液、样品和标准品,然后加入50μl生物素抗体,放入孵箱中两个小时。(实验中反应温度为室温)

(4)用配置好的洗涤液洗板4次,然后用移液器加入100μl的酶结合物,混匀放入孵箱中半个小时。

(5)用配置好的洗涤液洗板4次,用加样枪向孔中先加入100μlchromogenicagent,把酶标板放入37℃孵箱中15min。

(6)-终止-,-立刻放入酶标仪在--450-nm--测定吸光度-。

(7)用CurveExpert1.3生成标准曲线,根据标曲线求得样本TNF-α的浓度

1.2.8Q-PCR检测细胞内相关节点基因的表达量

  将-RAW-细胞-106/ml-铺于-6孔板中-,-贴壁后分别加入-APS-(-药物处理组-),PSP(-药物处理组-),-LPS-(-阳性对照组-),-APS-和-NiCl2-(-Ca2+通道阻滞组-),PSP和-NiCl2-(-Ca2+通道阻滞组-)-,-DMEM-培养基-(-阴性对照组-)处理-24h后-,收集培养的细胞。

1.2.8.1细胞总RNA抽提

(1)培养细胞的裂解:

1)按照说明书配制好各种溶液。

2)-用缓冲液洗细胞-3-遍后-,-加入适量的裂解液-,吹打裂解。

3)-充分裂解后吸到离心管中静置-3min-,-然后在冰冻离心机中离心-12000-转-,-5–min-。

4)用加样枪把上清吸到脱氧核糖核酸去除器中,然后在冰冻离心机中离心12000转,1min。

5)只留下脱氧核糖核酸去除器下面无酶管中的液体,并且加入相同体积的体积分数是70%的乙醇。

6)将上述液体混匀后立即加到RNA收集器中,然后在冰冻离心机中离心12000转,1min,舍去收集器下套管中的液体。

7)用移液器向RNA收集器中加入0.5ml的缓冲液RWA,然后在冰冻离心机中离心12000转,30s。

8)-舍去收集器下套管中的液体-,-用移液器向-RNA-收集器中加入-0.6ml-的缓冲液-RWB-。-然后在冰冻离心机中离心-12000-转,-30-s-。

9)重复步骤8。

10)-将-RNA-收集器放于-2-ml-无酶管上-,-冰冻离心机中离心-12000-转,-2-min-,-舍去无酶管中的液体-。

11)-将-RNA-收集器放于-1.5-ml-无酶管上-,-向收集器膜中央加入-60-μl-无酶水后静置-5–min-,-冰冻离心机中离心-12000-转,-2-min-。-无酶管中即为含有RNA的液体。(所有操作过程尽量在冰上操作)

1.2.9.1提取细胞的总蛋白

(1)按照说明书配制好各种溶液,实验中所需的磷酸盐缓冲液放入冰箱中预冷10min。

(2)-先用预冷的磷酸盐缓冲液洗细胞-5-次-,-然后加入适量预先配置好的裂解液-,-反复吹打数次后放到冰盒中静置-20-分钟。

(3)-放入冰冻离心机中离心-13000-g-,-十分钟-。

(4)上清液即为全蛋白提取物。

1.2.9.2测定蛋白浓度

按照试剂盒说明书,操作步骤如下:

(1)按照试剂盒说明书配制标准品-、-BCA-工作液-(-试剂-A-:-试剂-B-=-50-:-1-)。

(2)按照试剂说明书向96孔板中各标准品孔加入相应体积的标准品,并加磷酸盐缓冲液至总体积20μl。

(3)样品孔中先加2µl样品,然后加磷酸盐缓冲液至总体积20微升。样品和标准品孔均做3复孔。

(4)向-96-孔板中的样品孔和标准品孔加入-0.2–ml-的工作液。

(5)把-96-孔板放入-37摄氏度孵箱中半个小时-。

(6)立刻放入酶标仪在-562–nm-测定吸光度-。

(7)用CurveExpert1.3生成标准曲线,根据标曲线求得样本的蛋白浓度。

1.2.9.3SDS-PAGE电泳、转膜、ECL化学发光、显色。

(1)WesternBlot实验中个操作步骤严格按实验指导执行。其中,实验中的电泳上样量为50μg。

(2)-转膜过程严格在冰浴中进行-。

(3)化学发光是在miliporeHRP底物ECL发光液存在情况下进行。

(4)在百乐凝胶成像仪拍照-,-最后应用-Quantity-One-分析各条带的灰度值。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)