关键词:HBV MDR1 分子机制 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa

 

1.2方法

1.2.1构建质粒和细胞转染

(1)制备pCMV-Tag2B-LS、pCMV-Tag2B-MS、pCMV-Tag2B-SS和pCMV-Tag2B-X质粒:

A.按照表3.3配制PCR反应体系(50µl),各扩增片段引物序列如表3.2所示;

表3.3PCR反应体系(50µl体系)

Table3.3PCRreactionsystem(50µl)

试剂体积(µl)

dNTPMixture,2.5mM4

正向引物1

反向引物110´

Taqbuffer5

模板0.5

Taq酶0.5

RNase-freeddH2OUpto50µl

B.反应条件设置为:94℃预变性3min,扩增29个循环(每个循环为94℃40s+55℃40s+72℃1min),72℃终止延伸5min;

C.用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物,切胶回收产物片段备用;

D.分别用内切酶PstI和HandIII、EcoRI和XhoI双酶切pCMV-Tag2B载体,琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收载体片段;

E.将回收凝胶得到的LHBs、MHBs、SHBs和X基因片段分别与对应位点双酶切好的pCMV-Tag2B载体连接;

F.将连接产物分别转化入感受态大肠杆菌DH5α,加氨苄青霉素筛选培养过夜,挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行双酶切,并送至上海生物工程有限公司测序鉴定。

(2)细胞转染:

将制备好的表达LHBs、MHBs、SHBs和X蛋白的质粒pCMV-Tag2B-LS、pCMV-Tag2B-MS、pCMV-Tag2B-SS和pCMV-Tag2B-X,以及空载质粒pCMV-Tag2B分别转染HepG2和Huh7细胞。具体转染步骤同第一部分1.2.6。

1.2.2IH检测肝组织中MDR1的表达

(1)IH染色:

A.烤片:将切好的白片用石蜡包埋,放入烘干箱中烘蜡(60℃)1h;

B.脱蜡、水化:从烘干箱中取出切片,二甲苯浸泡15min´2,无水乙醇浸泡7min´2,90%酒精浸泡5min,80%酒精浸泡5min,70%酒精浸泡5min,ddH2O冲洗1min´3;

C.抗原修复:将切片放入装有柠檬酸修复液(PH6.0)的烧杯中,加热至沸腾25min;

D.阻断:卵白素孵育(室温)10min后,1´PBS缓冲液洗片5min´3;

E.封闭:5%山羊血清孵育(室温)10min后,1´PBS缓冲液洗片5min´3;

F.孵育一抗:加入anti-MDR1(1:100)稀释液,4℃孵育过夜;

G.孵育二抗:将切片复温至室温30min后,1´PBS缓冲液洗片5min´3;200µl生物素标记的羊抗兔IgG孵育1h,再次1´PBS缓冲液洗片5min´3;

H.DAB显色:滴加200µlDAB工作液显色5min,ddH2O冲洗终止显色,再1´PBS缓冲液洗片5min´3;

I.苏木素复染:哈氏苏木素复染1min后,再在0.25%的盐酸酒精中浸泡5s,用大量自来水冲洗,室温下晾干,封片;

J.将IH切片放入Envision/HRPsystem进行检测。

(2)阅片:

MDR1的表达量通过半定量分析来判断,即H-score总得分(0-300)=细胞着色强度(0-3)´阳性细胞百分比(1-100%)。组织切片染色结果的判读由两位具有资质的病理专家独立得出。

1.2.4TF芯片检测

(1)细胞转染:

将制备好的表达LHBs蛋白的质粒pCMV-Tag2B-LS,以及空载质粒pCMV-Tag2B分别转染至HepG2细胞。具体转染步骤同第一部分1.2.6。

(2)抽提细胞核蛋白:A.将细胞从CO2敷箱取出,弃去培养液,1´PBS缓冲液清洗细胞3次;B.根据试剂盒说明书,按表3.4配制3.0ml胞浆蛋白裂解液I;

表3.4胞浆蛋白裂解液I配方(3ml)

Table3.4PrescriptivesofcytoplasmproteinlysateI(3ml)

试剂体积

5×BufferA0.6ml

SolutionI(溶液I)30ul

SolutionII(溶液II)30ul

PMSFSolution15ul

dd-H2O2.325ml

总体积3.0ml

C.用1.0ml胞浆蛋白裂解液I漂洗细胞,弃去漂洗液;

D.根据试剂盒说明书,按表3.5配制1.02ml胞浆蛋白裂解液II;

E.用1.0ml胞浆蛋白裂解液II溶解细胞,溶解过程中用1ml移液枪反复吹打细胞;

表3.5胞浆蛋白裂解液II配方(1.02ml)

Table3.5PrescriptivesofcytoplasmproteinlysateII(1.02ml)

试剂体积

SolutionIII(溶液III)20ul

胞浆蛋白裂解液I1.0ml

总体积1.02ml

F.吸干裂解液,将细胞转至新的1.5mlEP管中,低温、高速离心(4℃,14,000rcf)5min;

G.小心分开上清液和沉淀,将胞浆蛋白上清液-70℃保存备用;

H.用0.5ml胞浆蛋白裂解液I漂洗沉淀,低温、高速离心(4℃,14,000rcf)5min,弃去上清液;

I.根据试剂盒说明书,按表3.6配制50ul核裂解液;

表3.6核裂解液配方(50ul)

Table3.6Prescriptivesofnucleoproteinlysate(50ul)

试剂体积

2×BufferB25ulSolutionI(溶液I)0.5ul

SolutionII(溶液II)0.5ul

PMSFSolution0.25ul

dd-H2O23.75ul

总体积50ul

J.用50µl核裂解液重悬沉淀,4℃下静置30min(期间每间隔5min剧烈震荡一次),低温、高速离心(4℃,12,000rcf)20min;

K.用BCA法测核蛋白上清液浓度(具体步骤同第一部分1.2.5(2)),并于-70℃保存备用。

(3)芯片准备:

本实验所使用的TranSignalProtein/DNAarrayI芯片含有345个已知TFs的DNA启动子结合序列(http://www.panomics.com)。实验具体步骤如下:

A.按照试剂盒说明书配制预处理缓冲液I、II;

B.在水浴箱中预热杂交液(42℃);

C.将含有345个TFs的芯片膜放入15cm带螺旋盖的离心管中(探针面处于管中心);D.将25ml1´预处理缓冲液I加入离心管中,45℃孵育5min;

E.弃去液体,将25ml1´预处理缓冲液II加入离心管中,45℃孵育10min;

F.弃去液体,用ddH2O充分清洗膜2次;

G.弃去液体,将5ml预热好的杂交液加入离心管中,42℃杂交2h。

(4)探针的孵育及分离:

A.取5µl抽提的核蛋白,放入0.5mlEP管中;

B.加入10µlTanSignal探针混合物+5µlRNase/DNasefreeddH2O,混匀;

C.15℃孵育30min,得到TFs-探针复合物;

D.将分离柱用500µl预冷好的1´分离柱孵育缓冲液清洗,低温、高速离心(4℃,10,000rcf)30s;

E.用20µl预冷好的1´分离柱孵育缓冲液稀释TFs-探针复合物,并转至分离柱,4℃孵育30min;

F.低温条件下离心(4℃,7,000rcf)30s,弃去离心废液;

G.将600µl1´分离柱洗涤缓冲液加入分离柱,置于新的收集管中,4℃孵育10min;

H.低温条件下离心(4℃,7,000rcf)30s,弃去离心废液;

I.再次600µl1´分离柱洗涤缓冲液加入分离柱,置于新的收集管中,低温条件下离心(4℃,7,000rcf)30s,弃去离心废液;

J.重复步骤G-I三次;

K.再次低温条件下离心(4℃,7,000rcf)30s,去除残留液体;

L.将60µl1´分离柱洗脱缓冲液加入分离柱,室温孵育5min,室温下高速离

心(10,000rcf)1miin;

M.将分离柱中收集到的探针置于冰上备用。

(5)杂交:

A.收集到的洗脱探针95℃高温变性3min,迅速置于冰上2min,再放入离心管中,42℃杂交12h;

B.去除杂交液,在42℃条件下分别用50ml杂交洗涤液I和50ml杂交洗涤液II洗膜各20min´2。

(6)化学发光检测:

芯片与探针杂交后,加HRP标记的链亲和素抗体与化学发光底物反应。X射线胶片曝光在胶片上显示检测结果。

(7)图像采集与数据分析:

A.调整曝光时间,使大多数点阵在X胶片曝光过程中有相同的信号强度;

B.用扫描仪扫描胶片上的图象,并以图片文件的形式保存;

C.在ScanAlyze软件中,将点阵灰度转化为数字型数据,并将结果储存为MicrosoftExcel文件格式;

D.点阵信号强度2倍及其以上的增强或减弱都被认为是有意义的。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测验证TF活性

(1)细胞转染:

A.将表达LHBs和X蛋白的质粒pCMV-Tag2B-LS、pCMV-Tag2B-X,以及空载质粒pCMV-Tag2B分别转染至HepG2细胞。具体转染步骤同第一部分1.2.6;

B.次日,先将500ng待转的萤火虫荧光素酶报告基因质粒(HRE报告基因质粒/pGL3-MDR1报告基因质粒)和15ng海肾荧光素酶报告基因内参质粒pRL-SV40混匀,再用50ulDMEM培养液稀释,室温孵育5min;

C.用50ulDMEM培养液稀释l.5ulLipofectamine®2000,室温孵育5min;

D.将报告基因质粒稀释液加入脂质体稀释液,混匀,室温孵育20min;

E.将上述转染复合物加入细胞培养板中,轻轻混匀,放入5%CO2细胞培养箱(37℃)继续培养。

(2)荧光素酶活性测定:

A.转染24h后,根据试剂盒说明书配制1×细胞裂解(PLB)工作液:120mlddH2O+30ml5×PassiveLysisBuffer),4℃保存备用;

B.将LARⅡ干粉溶于10ml荧光素酶检测缓冲液,混匀后配制成荧光素酶分析试剂LARⅡ,-70℃保存备用(避光);

C.用5000ulStop&Glo缓冲液稀释50×终止液,配成终止工作液,-20℃保存备用;D.一次性吸管去细胞培养板中培养基,加入1´PBS缓冲液反复吹打细胞至脱落,将细胞悬液移至新的1.5mlEP管,3000rpm离心3min;

E.每孔用100ul1´PLB工作液重悬细胞,孵育15min后,室温离心(8,000rpm)5min。

F.将上清液移入新的1.5mlEP管中,加入12.5ulLARⅡ,移液枪轻轻吹打6次,立即在GloMax20/20发光检测仪中检测萤火虫荧光素酶激发底物所释放的荧光信号RLUS1;

G.再将12.5ul终止工作液加入上述反应体系中,移液枪轻轻吹打6次,再次放入GloMax20/20发光检测仪,检测内参质粒pRL-SV40携带的海肾荧光素酶激发底物所释放的荧光信号RLUS2;

H.计算每组萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值RLUS1/RLUS2,结果即是各组质粒转染细胞后的荧光素酶活性。所有荧光素酶报告基因检测均至少重复三次。

(4)转膜:A.将尼龙膜剪至大小合适,0.5´TBE缓冲液浸泡10min;

B.按照第一部分1.2.5(4)方法制作―三明治‖,并行电转移;

C.转膜完成后,小心取出尼龙膜,轻轻吸掉多余液体,平放备用。

(5)DNA交联:

将电转好的尼龙膜放入超净工作台中,距紫外灯约5cm左右,照射15min。

(6)检测生物素标记的探针:

A.将封闭液和洗涤液放入37℃水浴箱中溶解;

B.将交联过的尼龙膜放入盛有15ml封闭液的容器中,水平摇床上缓慢振荡15min;

C.弃去液体,再将尼龙膜放入另一个盛有15ml封闭液+7.5µlStreptavidin-HRPConjugate混合液的容器中,水平摇床上缓慢振荡15min;

D.配制125ml1´洗涤液:25ml5´洗涤液+100mlddH2O;

E.弃去C步液体,将尼龙膜转至另一盛有20ml1´洗涤液的容器中,洗涤1min;

F.弃去洗涤液,加入20ml1´洗涤液,水平摇床上缓慢振荡5min;

G.重复步骤F三次;

H.将洗涤干净的尼龙膜放入另一盛有20ml检测平衡液的容器中,水平摇床上缓慢振荡5min;

I.将ECLReagentA和ECLReagentB按照1:1的比例配成ECLReagent工作液;

J.取出尼龙膜,吸去多余水分,平置,并滴加10mlECLReagent工作液,室温静置3min;

K.取出尼龙膜,吸去多余水分,再放入两片保鲜膜中间,并固定在片夹内;

L.X射线胶片曝光在胶片上显示检测结果。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)