关键词:MDR1 HBV转录 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa

 

1.2方法

1.2.1人肝癌细胞株HepG2.2.15转染ABCB1siRNA(ReverseTransfection):

(1)分组(均稀释至终浓度50nM):

A.siNegativecontrol组:250µlOpti-MEM+5µlsiRNA;

B.siRNAABCB1-1组:250µlOpti-MEM+5µlABCB1siRNA;

C.siRNAABCB1-2组:250µlOpti-MEM+5µlABCB1siRNA;

D.siRNAABCB1-3组:250µlOpti-MEM+5µlABCB1siRNA;

(2)配制250µlOpti-MEM+5µlLipofectamine®2000,4管,均加入对应标记好的EP管里,轻轻吹打混匀,室温静置5min;

(3)将Lipofectamine®2000稀释液和siRNA稀释液轻轻混匀,室温静置20min;

(4)将转染复合物加入对应标记好的细胞培养板(ABCB1siRNA转染的终浓度为100nM);

(5)0.25%胰蛋白酶消化细胞,离心后用无抗生素DMEM培养基重悬细胞,每孔加入约2´105个细胞(贴壁后细胞融合度约50-60%);

(6)每孔用自制无抗全陪(90%DMEM+10%FBS)补齐,轻轻摇晃均匀;

(7)6h后更换为含双抗的全面培养基;

(8)48h后收取细胞上清液检测相应指标,并按照前述步骤裂解细胞,提取细胞RNA及蛋白的方法提取RNA、蛋白,用于后续实验。

1.2.2转染ABCB1siRNA后干扰效率的检测

(1)qRT-PCR检测ABCB1mRNA水平的表达:

人肝癌细胞HepG2.2.15转染NegativecontrolsiRNA/ABCB1siRNA48h后裂解细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA后进行qRT-PCR检测(方法同第一部分1.2.4)。所有qRT-PCR检测均至少重复三次。

(2)WB检测ABCB1蛋白水平的表达:

人肝癌细胞HepG2.2.15转染NegativecontrolsiRNA/ABCB1siRNA48h后裂解细胞,提取总蛋白,变性后进行WB检测(方法同第一部分1.2.5)。所有WB检测均至少重复三次。

1.2.4qPCR检测转染ABCB1siRNA后HBV复制中间体的表达

(1)提取细胞内HBV核心颗粒DNA:

A.人肝癌细胞HepG2.2.15转染NegativecontrolsiRNA/ABCB1siRNA48h后收集细胞;

B.取适量0.25%胰蛋白酶消化收集的细胞,并转移至对应标记的1.5mlEP管中,1´PBS缓冲液清洗两遍,室温下离心(900rcf)3min,弃上清;

C.将200μLRIPA裂解液加入每个EP管中,37℃下孵育30min;

D.室温下离心(13500rcf)5min,将上清液移至新的1.5mlEP管中,每管加入4μLDNaseI,37℃下水浴4h;

E.重复步骤D一次;

F.将500μL预冷的35%PEG8000(1.5M)加入每管,充分混匀后,冰浴2h,低温、高速离心(4℃,12,000rcf)15min,小心弃去上清液;

G.将450μL蛋白酶K消化液、20μL蛋白酶K、30μL灭菌超纯水加入沉淀中,混匀后放置于45℃恒温水浴箱中过夜;

H.将500μL酚氯仿加入每管,混匀后,室温下高速离心(20,000rcf)5min,吸取上层液体至另一新的EP管中,加入等体积的酚氯仿抽提HBVDNA;

I.重复步骤H两次;

J.将等体积的异丙醇加入每管,颠倒数次混匀后,低温、高速离心(4℃,18,000rcf)20min,小心弃去上清液;

K.将200μL75%乙醇加入每管,颠倒数次洗涤沉淀,低温、高速离心(4℃,18,000rcf)20min,小心弃去上清液,超净台中自然风干;

L.待乙醇完全挥发后,用20μL灭菌的超纯水溶解DNA,于-20℃保存备用。

(2)qPCR检测HBV核心颗粒DNA表达量:

A.我们根据HBV基因组保守区2150nt-2300nt位点的序列,设计了HBVDNA特异性的扩增引物。引物序列如下:

forwardprimer,5′-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3′

reverseprimer,5′-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3′

B.按照定量PCR试剂说明书配制反应体系(20µl体系),如表2.2。每个样

本设计3个复孔。所有操作均在冰上进行;

表2.2定量PCR反应体系(20µl体系)

Table2.2QuantitativePCRreactionsystem(20µl)

试剂体积(µl)

SYBRGreenqPCRMixP10

正向引物0.5

反向引物0.5

DNA2

ddH2O7

C.DNA标准品按比例稀释后,同样按照表2.2配制PCR反应体系;

D.按照试剂说明书设置定量PCR扩增程序,并启动反应;

E.分析扩增曲线和溶解曲线,确定对应荧光阈值循环数(Ct值);

F.根据标准品Ct值绘制标准曲线,并据此计算HBVDNA的绝对定量值。所有qPCR实验均至少重复三次。

1.2.5ELISA检测转染ABCB1siRNA后HBsAg、HBeAg的水平

(1)人肝癌细胞HepG2.2.15转染NegativecontrolsiRNA/ABCB1siRNA48h后收集上清,备用;

(2)将ELISA试剂盒放入37℃恒温箱中复温10min;

(3)按照试剂说明书稀释标准品和细胞上清液;

(4)配制洗脱液、一抗稀释液和二抗稀释液;

(5)将稀释好的标准品、细胞上清液按设计好的顺序加入ELISA孵育96孔板中,37℃恒温箱中孵育2h;

(6)弃掉孵育液体,每孔加入400ul洗脱液洗脱(重复4遍),然后风干96孔板;

(7)将100ul配置好的一抗稀释液分别加入96孔板中,37℃恒温箱中孵育1h;

(8)弃掉上清液,按步骤(6)方法再次洗脱96孔板,风干后,每孔加入200ul配制好的二抗稀释液,室温孵育45min;

(9)弃掉上清液,按步骤(6)方法再次洗脱96孔板,风干后,每孔加入100ulTMB反应液,室温孵育30min(避光);

(10)每孔加入50ul反应终止液终止反应;

(11)在酶标仪450nm波长下测量每孔OD值;

(12)根据测得标准品的OD值绘制标准曲线,并据此计算细胞上清液中HBsAg/HBeAg的浓度。所有ELISA实验均至少重复三次。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)