关键词:MDR1 慢性乙型肝炎 肝组织 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa

 

1.2方法

1.2.1蛋白质样品的制备及iTRAQ标记

(1)人肝组织总蛋白的提取:

将冻存人肝组织从液氮罐中取出,加入适量尿素TEAB裂解液(7M尿素+1mg/mlDNA酶I+1mM四氧嘧啶+1mMPMSF)后,研磨棒快速研磨肝组织。瞬时离心后,匀浆仪反复匀浆(4℃,5min´3)。高速低温离心(15,000rpm,4℃,30min)匀浆后的组织混悬液,取蛋白上清液至已对应标记好的新EP管,-70℃超低温保存。

(2)各个样本总蛋白浓度的测量:

采用2DQuantKit蛋白定量试剂盒,在波长480nm处,分别测定蛋白标准品和蛋白样本的吸光光度,并将光度值输入Excel表,得到标准曲线,再计算出待测样本的蛋白浓度。

(3)iTRAQ标记所需样品体积的计算:

按照本研究预先设计的iTRAQ标记路线(见图1.1)(等质量混合7例无HBV感染人群肝组织样本的总蛋白混合液100ug,体积20µl;7例CHB患者肝穿刺组织的蛋白液分别为100ug,20µl),计算标记时所需各个蛋白样本的体积,体积不足20µl的用尿素TEAB裂解液补齐。

(4)iTRAQ标记:

本实验共标记iTRAQ两组:第一组CHB患者为HBeAg阳性,第二组CHB患者为HBeAg阴性。7例无HBV感染人群肝组织样本的总蛋白混合液均标记为

113;7例CHB患者肝穿刺组织的蛋白液分别标记为:

CHB(HBeAg-positive/negative)patient1,114标记;

CHB(HBeAg-positive/negative)patient2,115标记;

CHB(HBeAg-positive/negative)patient3,116标记;

CHB(HBeAg-positive/negative)patient4,117标记;

CHB(HBeAg-positive/negative)patient5,118标记;

CHB(HBeAg-positive/negative)patient6,119标记;

CHB(HBeAg-positive/negative)patient7,121标记;

实验具体步骤如下:

A.分别将2µl还原剂加入16组样品蛋白液中,振荡混匀后瞬时离心,37℃条件下反应1h;

B.将1µl阻断剂分别加入每管蛋白样品液中,振荡混匀后瞬时离心,室温静置10-15min;

C.将样品蛋白溶液和序列级变性胰蛋白酶分别加入溶解缓冲液中,振荡混匀,再分别加入4μl胰酶,充分混合后,37℃过夜;

D.真空抽干(45℃)已降解为肽段的上述蛋白样品,至为白色结晶;

E.将30µl溶解缓冲液加入每管白色结晶中,溶解后瞬时离心,备用;

F.将50µl异丙醇缓冲液分别加入113、114、115、116、117、118、119、121标记中,振荡混匀后瞬时离心,室温(20℃)过夜;

G.根据实验设计,将标记试剂分别加入到对应肽段溶解液中;

H.将标记好的肽段溶液混合成一管,真空抽干(45℃)。

I.用C-18固相脱盐柱进行固相脱盐,再真空抽干(45℃)。

1.2.2固相pH梯度等电聚焦

(1)用450µl水化液溶解固相脱盐后的肽段结晶;

(2)将StripHolder正确连接于IPGphor等电聚焦仪上;

(3)将溶解后的肽段溶液连续、均匀、缓慢地加入StripHolder;

(4)揭掉DryStripgel(pH3-10NL)的塑胶保护膜,小心整体放入含肽段溶液的StripHolder中;

(5)用DryStripCoverFluid完全覆盖DryStripgel,并盖上StripHolder盖子;

(6)确认StripHolder与聚焦仪面板电极的连接,关闭安全盖;

(7)设置程序:20℃,30V低电压水化14h、500V1h、1000V1h,最后稳定在8000V下聚焦8.5h;

(8)将DryStripgel按0.5cm宽度切割成48个片断,分别加入100μl的萃取溶剂(2%乙腈+0.1%甲酸),37℃下孵育1h;

(9)用C-18固相脱盐柱脱去萃取所得精细肽段的盐分,冻干。1.2.3质谱分析

(1)将上述肽段结晶用含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解后,通过液相色谱及串联质谱仪进行鉴定;

(2)数据采集:捕获300-1800m/z质量范围内的离子信息(正离子模式)。

(3)数据处理:ProteinPilot2.0版蛋白定量分析软件;

(4)数据库:UniProt数据库(http://www.uniprot.org/);

(5)鉴别与筛选蛋白标准:所标记样品多肽的相对丰度是通过113-119Da和121Da处报告基团的相对丰度值来定量的。蛋白的识别要求在至少2个独特肽段的基础上,取95%可信区间(confidenceinterval,CI)以及5%假阳性率(falsediscoveryrate,FDR)。P值<0.05视为有统计学差异。

1.2.4qRT-PCR检测组织/细胞中目的基因的表达

(1)组织/细胞总RNA的提取(Trizol法)及其浓度测量:

A.将1mlTrizol加入装有适量组织/细胞的RNase-freeEP管中,室温静置5min;

组织:加入Trizol后,EP管置于冰上,匀浆仪反复匀浆3次,每次5min。细胞:取出细胞培养皿,弃尽培养液,PBS冲洗3次,吸尽残留液体后,再加入Trizol。

B.将组织/细胞裂解产物转入1.5mlEP管中,低温、高速离心15min(4℃,12,000rcf);

C.上清液转入新的EP管中,加入200μl三氯甲烷,上下颠倒振荡混匀,室温静置5min;

D.低温、高速离心15min(4℃,12000rcf);

E.分两次取上层液相约500μl液体转入新的EP管中,加入500μl异丙醇,上下颠倒振荡混匀,室温静置10min;

F.低温、高速离心10min(4℃,12000rcf);

G.一次性枪头吸去上清,将1ml75%乙醇加入管底,洗涤总RNA沉淀,再低温、高速离心5min(4℃,7500rcf)。此步骤重复2次;

H.两次离心后用一次性枪头吸去上清,超净工作台中室温晾干5-10min;

I.加入20-40µlRNA-free水,溶解RNA沉淀;

J.紫外分光光度仪测量RNAOD值。

表1.2基因组DNA去除体液(10µl体系)

Table1.2GenomicDNAerasersystem(10µl)

试剂体积(µl)

总RNA1µg/密度5´

gDNAeraserbuffer2

gDNAeraser1

Nuclease-freewaterupto10

反应条件:42℃,2min;4℃保存。

(2)将RNA逆转录合成cDNA:

A.按照表1.2配方配制基因组DNA去除液(10µl体系);

B.将去除DNA杂质的总RNA置于Dryblockheater中变性5min(65℃),迅速放置冰上冷却5min;

C.按照逆转录试剂盒说明书配制反应液(20µl体系),如表1.3:

表1.3RNA逆转录反应体系(20µl体系)

Table1.3RNAreversetranscriptionreactionsystem(20µl)

试剂体积(µl)

PrimerMix15´

RTbuffer4

RNA1.6ug/密度

RTEnzymeMix1

Nuclease-freeWterupto20

反应条件:37℃恒温水浴,15min;98℃灭酶5min;-70℃保存。

1.2.5WB检测组织/细胞中目的蛋白的表达

(1)组织/细胞总蛋白的提取:

A.组织:将适量肝组织剪碎,加入500µlRIPA裂解液,冰上匀浆破碎组织(5min3);冰上静置匀浆液30min,低温、高速离心30min(4℃,13200rpm),吸取上清液备用;

B.细胞:将细胞从CO2细胞培养箱中取出,弃去培养基后,加入PBS洗涤细胞3次。将细胞培养板倾斜地放置在碎冰上,将50μlRIPA裂解液从上至下地毯式滴入每孔细胞培养板,再迅速用细胞刮将细胞刮下。收集细胞混悬液至EP管中,4℃静置20min;低温、高速离心5min(4℃,12000grcf),吸取上清液备用;

(2)蛋白浓度的测量(BCA法):

A.根据说明书配制BCA工作液(试剂A:B=50:1);

B.稀释蛋白标准品:将5mg/mlBSA蛋白标准品用0.9%生理盐水稀释至终浓度为1.25mg/ml的标准蛋白样品;

C.将稀释好的标准蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20µl体积分别加入96孔板中,0.9%生理盐水补足每孔体积至20µl;

D.将2µl待测蛋白样品依次加入96孔板中,再加入18µl0.9%生理盐水;

E.将配好的200µlBCA工作液分别加入标准蛋白和待测蛋白样品孔中,轻轻混匀,37℃下孵育30min;

F.酶标仪测定各孔吸光光度值(562nm),根据标准蛋白样品光度值绘制标准曲线,并据此计算待测蛋白样品浓度。

(3)电泳:

A.SDS-PAGE凝胶的配制:清洁、干燥制胶用玻璃片,并将其压至卡槽中。按照表1.5配方配置SDS凝胶(10ml体系)。先将分离胶灌入,并用异丙醇封闭胶面,室温静置1.5h;待分离胶完全聚合后,弃去异丙醇,并用自来水小心冲洗;滤纸干燥后再灌入适量浓缩胶,并插好梳子,室温静置1h;

表1.5SDS-PAGE电泳凝胶配方(10ml)

Table1.5PrescriptivesofSDS-PAGE(10ml)

试剂10%分离胶(ml)5%浓缩胶(ml)

ddH2O3.86.8

30%Acr-Bis(29:1)3.41.66

1MTris(pH8.8)2.6—

1MTris(pH6.8)—1.26

10%SDS0.10.1

10%AP0.10.1

TEMED0.0040.01

B.待整个凝胶完全聚合后,将其安装在电泳槽中,加入适量1´Tris-甘氨酸电泳缓冲液,并小心拔出梳子;

C.根据所测蛋白浓度计算等质量蛋白所需各样品蛋白的加样体积,将其与6´上样缓冲液按5:1体积混合,其余体积用蛋白裂解液配平,95℃加热变性10min;

D.将蛋白Maker和变性后的蛋白样品分别加入相应胶孔中,空孔用6´上样缓冲液补齐;

E.80V电泳使溴酚蓝经过浓缩胶;再100V恒压电泳约1.5h(使溴酚蓝至接近分离胶底部1cm左右)。

(4)电转(湿转法):

A.电泳完成后取出凝胶(切去浓缩胶),与PVDF膜(甲醛浸泡1min)、滤纸、海绵一道浸泡在1×电转缓冲液中;

B.依次将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按照从阴极(黑色)到阳极(透明)的顺序夹入电转夹板;

C.将电转夹板按正确电极方向放入电转槽,槽中加入适量1×电转缓冲液;

D.4℃冰箱中,100V电转过夜。

(5)封闭、孵育抗体及显影:

A.封闭:电转完成后,用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜,并置于摇床上慢速摇晃1h(室温);

B.孵育一抗及洗膜:将封闭后的PVDF膜封入按照说明书推荐比例稀释的一抗溶液溶液中,水平摇床上慢速摇晃过夜(4℃)。1×TBST缓冲液洗膜3次(每次10min);

C.孵育二抗及洗膜:将PVDF膜封入用5%脱脂牛奶按1:5000比例稀释的含HRP的二抗溶液,摇床上慢速摇晃1h(20)。洗膜步骤同前;

D.蘸干PVDF膜,将配好的ECL化学发光试剂(A:B=1:1)均匀滴至膜表面,再将膜水平放入凝胶成像系统曝光显影;

E.用ImagineLab软件分析蛋白相对表达量。所有WB实验均至少重复三次。

1.2.6转染质粒

(1)细胞铺板:

转染前一天,将培养好的细胞从CO2培养箱中取出;B.生物安全柜中操作,弃尽全培,1´PBS缓冲液清洗后,1ml0.25%胰酶消化细胞1-2min;

C.一次性吸管吹打细胞后转入15ml离心管中离心(室温,900rcf)3min,

D.配制不含抗生素的全面培养基:90%DMEM+10%FBS;

E.倒掉离心管中上清液,加1-2ml自配全培,吹散细胞;

F.以每孔80%的融合度铺板,并用移液枪吸取自配全培补齐每孔,摇匀细胞后,放回CO2培养箱中培养过夜。

(2)配制转染溶液:

A.转染当天,将铺板细胞从CO2培养箱取出,弃尽全培后,1´PBS缓冲液冲洗两遍;

B.根据质粒浓度计算需要体积,并用对应体积Opti-MEM培养基(1µg质粒对应加50µlOpti-MEM)稀释,备用;

C.Lipofectamine®2000的体积:质粒的质量=3:1,3µlLipofectamine®2000对应加50µlOpti-MEM培养基稀释;

D.将Lipofectamine®2000稀释液配好后静置5min,再加至质粒稀释液中混匀,室温静置15min。

(3)转染:

A.先在每孔细胞中加入需补齐的DMEM培养基体积,再将转染混悬液分别加到对应孔板中,放回CO2培养箱继续培养;

B.4-6h后换成无双抗的全面培养基;

C.48h后裂解细胞提取RNA和蛋白用于后续实验(方法同前述)。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)