关键词:Westernblotting 细胞 AQP9过表达 肝癌 SMMC-7721 细胞侵袭 康宁 corning 耐思 NEST 伯乐 BIO-RAD 硕华 Sorfa

 

1)清洗玻璃板,并烘干,用胶条封闭胶槽,防止漏胶;

2)依据目标蛋白分子量大小配制不同浓度的分离胶,沿槽边缘缓慢加入分离胶6.5mL,用无水乙醇液封,槽中间加少量超纯水,塑料薄膜密闭,于37℃恒温孵育30分钟;

3)弃无水乙醇,并用滤纸吸干,配制完浓缩胶后缓慢加入槽内,立即插入梳子,电泳槽中间加适量超纯水,塑料薄膜密闭,过夜;

4)弃液体,拔掉胶条,电泳槽内槽中加入适量电泳液(应浸没金属铂丝),外槽中加满电泳液,拔出梳子并去除加样孔内的气泡。

5)在第一个孔内加入5μLMarker,随后依次按实验分组要求向孔内加入50μg蛋白样本,60mv恒压电泳,当Marker条带分开后换成80mv继续电泳,直至蛋白跑至胶底部;

6)根据Marker指示切胶,根据凝胶大小剪出6张同等大小的滤纸及PVDF膜,PVDF膜上做标记并放入甲醇中活化60S,打开转膜夹,依次放置海绵,3层滤纸,胶条,PVDF膜,3层滤纸及上层海绵垫。予以250mA恒流转膜,转膜时间根据蛋白质的分子量的不同而异(一般约1KD每分钟)。

7)将PVDF膜浸入封闭液中,摇床缓慢摇动60分钟。

8)用一抗稀释液按适当比例稀释抗体(见前表),取1-2mL置于PVDF膜蛋白面上,4℃孵育过夜。

9)TBST洗膜5min×3次,抗兔或抗鼠二抗置于PVDF膜蛋白面上,37℃恒温箱中孵育1h;

10)TBST洗膜4次,每次5分钟,配制ECL发光液(A液:B液=1:1),将PVDF膜蛋白面朝上,加入ECL发光液,置于凝胶成像仪暗室中曝光显影;

11)采用QuantityOne软件分析结果。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)