关键词:双氢青蒿素 脑胶质瘤 细胞增殖 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

人恶性脑胶质瘤细胞系U87,U251,U343,HS683均来自于中南大学湘雅医学院临床药理研究所,细胞用含有10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基培养,在37℃,5%CO2细胞房中的细胞培养箱中进行常规培养。当细胞生长至细胞培养皿总面积的80%融合时,用1mL含0.25%胰酶和0.02%EDTA的碧云天胰酶消化液消化,并传代至新的培养皿中进行培养。

1.2.2MTT分析

人恶性胶质瘤细胞系U87,U251,U343,HS683均以5×103的密度接种于96孔板中,待贴壁完全且生长状态良好后,分别使用含有0.1%DMSO的溶剂组(阴性对照组)和50,100,150,200,250,300,350μM双氢青蒿素(DHA)处理24、48小时后,采用MTT法检测DHA对人恶性胶质瘤细胞系U87,U251,U343,HS683的细胞生长增殖率的作用。MTT又称MTT比色法,它的工作原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积于细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解线粒体中的蓝紫色结晶甲瓒,可以使用紫外酶标仪在540nm波长处测定其光吸收值。在一定细胞数量范围内,MTT结晶形成的量与活细胞数目成正比,细胞增殖越多越快,活细胞数目越多则此吸光值越高,可以作为细胞活力的检测指标。MTT法的操作步骤:(1)用250ml灭菌超纯水溶解250mgMTT粉末,配制成标准浓度为1mg/ml的MTT工作液,现配现用;(2)人恶性胶质瘤细胞系U87,U251,U343,HS683均以5×103的密度接种于96孔板中,待贴壁完全且生长状态良好后,分别使用含有0.1%DMSO的溶剂组(阴性对照组)和50,100,150,200,250,300,350μM双氢青蒿素(DHA)处理24、48小时后,移除各孔中原有的培养基,随后依次在每孔中用移液枪(移液枪不接触孔壁)加入100μlMTT(1mg/ml)的工作液;(3)待各孔均加完MTT(1mg/ml)工作液后,将96孔板重新放回37℃,5%CO2细胞培养箱中避光孵育3小时;(4)3小时后从细胞培养箱中取出96孔板并用移液枪吸尽移除每孔中加入的MTT工作液,随后每孔中加入50μl二甲基亚砜(DMSO)溶解线粒体中的蓝紫色结晶甲瓒;(5)加完二甲基亚砜(DMSO)后,用锡箔纸包裹好96孔板,在避光良好的情况下将96孔板放在水平震荡仪上低速震荡5分钟;(6)在紫外酶标仪540nm波长处测定吸光值;(7)细胞相对活力=(加药处理组吸光值的平均值/空白溶剂对照组吸光值的平均值)×100%

1.2.3显微镜观察凋亡细胞形态改变

将细胞种于6孔板中贴壁完全后,用含有0.1%DMSO的溶剂组(阴性对照组)和100μM、200μM双氢青蒿素(DHA)处理人恶性胶质瘤系24小时,在倒置显微镜(Nikon,日本)下观察DHA对脑胶质瘤细胞形态的影响,观察其是否有形态的改变,是否出现凋亡形态。

1.2.4平板克隆形成实验

(1)将细胞活性良好并处于对数生长期的细胞用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的碧云天胰酶消化液消化成单细胞悬液,接种于6孔板,注意每孔接种时细胞分散均匀,每孔300个细胞,;(2)待细胞在培养箱中24h贴壁后,加入100μM、200μM双氢青蒿素或者同体积的DMSO的全营养培基连续培养10天,每隔三天更换新鲜加药培养基;(3)10天后取出6孔板,并用移液枪将各孔中原有的细胞培养液吸尽弃去,用PBS清洗三次后用4%的多聚甲醛固定5分钟,最后使用0.1%的结晶紫染色15分钟;(4)细胞染色15分钟后用PBS清洗三遍,并通过倒置显微镜(Nikon,日本)显微镜拍照记录四株细胞株细胞聚落大小及形态;(5)拍照后,用移液枪向每孔中加入500μl的二甲基亚砜(DMSO),使得已经与细胞核结合的结晶紫,在紫外酶标仪540nm条件下检测其吸光值以定量测定双氢青蒿素对脑胶质瘤细胞U87,U251,U343和HS683聚落形成能力的影响。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm