关键词:衰老期 小鼠 心脏舒张功能障碍 cTnI基因 遗传机理 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

(1)DNA与蛋白交联

1)选取各组心脏组织,新生选取5-6颗心脏,2w选取2颗,其余各组均选1颗心脏。各组心脏组织放于1.5mlEP管中,利用眼科剪将组织剪碎,约1mm3大小即可;

2)将剪碎的组织转移入15ml锥形离心管内,加入9ml预冷的PBS,摇匀;

3)每个锥形管中加入275ul浓度为37%的甲醛,摇匀,室温下反应约10分钟,待组织中DNA与蛋白充分交联;

4)每管中加入10×甘氨酸1ml,混匀,室温下反应10分钟,以终止交联;

5)配制洗涤液,1ug/ml蛋白酶抑制剂:10ml预冷PBS;

6)将4部锥形管4°3000rpm离心2分钟,弃上清,利用5部洗涤液对沉淀物进行漂洗,反复3次后弃上清,将沉淀组织转移入1.5mlEP管中。

(2)超声切割DNA

1)配制超声切割用裂解液,200ulSDSLysinebuffer加2ul蛋白酶抑制剂(可保证20mg左右心脏组织裂解);

2)利用超声破碎仪,将含有各组心肌组织的EP管放入超声切割架上,注意若有空缺应用空EP管予以补充,选取中频,4°低温切割30分钟左右;

3)吸取超声切割后的DNA溶液2ul,进行琼脂糖电泳,观察DNA切割情况是否满意,下图为理想情况,即DNA片段主要分布于200-1000bp;

(3)交联Protein/DNA的免疫共沉淀(IP)

1)配制IP反应液。•每组IP需要900μL稀释液与4.5μL的蛋白酶抑制剂II.

•免疫共沉淀应包括阳性对照(Anti-RNA聚合酶II),与阴性对照(普通小鼠IgG),与目标抗体(使用者自备).建议用户使用与目标抗体同种属的阴性对照IgG.

2)准备数个装有100μL打断的交联染色质的EP管放在冰上来完成所需数量的免疫共沉淀.•如果多个免疫共沉淀都将用相同制备的染色质来完成,那就将所需数量的免疫共沉淀整个放入一个大型管中,它将能够为每次IP容纳1.1mL.

3)每个EP管中加入1)部配制的IP反应液和100ul超声切割后DNA。

4)将60ul琼脂糖蛋白G加入EP管中(总体积的50%),在移液之前轻柔的旋转来使其混合。

5)放在摇床上4°C孵育1小时.

6)对颗粒琼脂糖进行简短离心(3000-5000xgfor1min).•不可高速旋转蛋白G琼脂糖珠.用力过度g-force可能使珠子粉碎或变形并使颗粒不一致.

7)取出10μL(1%)上清液作为input并4°C保存直到SectionD,step1.•如果不同的染色质制剂通过这个原始记录在一起被执行,从每一组中移去1%的染色质作为input.

8)收集上清液并且分发1mL等量试剂到每一个干净的离心管.丢弃琼脂糖颗粒.

9)将免疫共沉淀的抗体加入上清液部分:•anti-RNA聚合酶作为阳性对照,每管中加入1.0μg抗体.

•正常小鼠IgG作为阴性对照,每管中加入1.0μg抗体.

•对于用户提供的抗体与控制器,在每管中加入1-10μg的抗体.抗体的恰当数量需要由经验来确定.

10)在4°C下旋转孵育过夜.

11)在每一个IP中加入60μL的蛋白G琼脂糖,并在4°C下旋转孵育1小时.

12)蛋白G琼脂糖颗粒经过短暂的离心后(3000-5000xg,1minute)移去上清液部分.

13)用每种冷冻缓冲液1mL(成分如下所列)洗涤蛋白G琼脂糖-抗体/染色质复合体使颗粒悬浮,在摇床上孵化3-5分钟之后经过短暂的离心(3000-5000xg,1minute)再小心的丢弃上清液部分:a.低盐免疫复合物洗涤液(Catalog#20-154),洗涤一次

b.高盐免疫复合物洗涤液(Catalog#20-155),洗涤一次

c.氯化锂免疫复合物洗涤液(Catalog#20-156),洗涤一次

d.TE缓冲液(Catalog#20-157),洗涤两次

(4)蛋白/DNA复合物的洗提

1)为所有的IP管与所有input管准备洗脱液.•为每一管准备200μL的洗脱液:10μL20%SDS,20μL1MNaHCO3与170μL无菌蒸馏水.

2)同样INPUT各组也需加入200ul洗脱液.

3)先加入100ul洗脱液在IP管中.

5)室温下孵化15分钟.

6)琼脂糖颗粒经过短暂离心后(3000-5000xgfor1minute)收集上清液到新的离心管中.

7)重复steps4-6且使洗出液结合(总容积=200μL).

(5)Protein/DNA复合物逆转交联为游离DNA

1)在所有管子中(IPs与input)加入8μL5MNaCl,且在65°C下孵育4-5h,使DNA–蛋白交联逆转.在这一步后样本可被储存于-20°C,在第二天再继续原始记录.

2)在所有管子中加入1μL的RNaseA且在37°C下孵化30分钟.

3)在每管中加入4μL0.5MEDTA,8μL1MTris-HCl与1μL蛋白酶K在45°C下孵化1-2小时.(6)用旋转柱使DNA纯化

1)从来自SectionE的每一个样本管中,去掉一个集合管的自旋过滤器与一个单独收集管.

2)加入1mL的粘合剂―A‖到每个200μLDNA样本管并完全混合.•每1个体积的样本应加入5个体积的粘合剂―A‖.

•可能会出现沉淀物.这不会影响此步.

3)转移600μL的样本/粘合剂―A‖混合物到采集管的旋转过滤器中.

4)30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

5)从采集管上取下旋转过滤器,保存采集管并弃去液体.•如果在Step2形成了沉淀物,有可能会出现在采集管的底部,但不影响此步.

6)将旋转过滤器放回到同一个采集管中.

7)转移从Step2余下的600μL的样本/粘合剂―A‖混合物到旋转过滤器并重复steps4-6.

8)加入500μL的洗涤剂―B‖到采集管的旋转过滤器中.

9)30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

10)从采集管上取下旋转过滤器,保存采集管并弃去液体.

11)将空余的旋转过滤器放回到同一个采集管中.

12)30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

13)丢弃采集管与液体.

14)将旋转过滤器放入一个干净的采集管.

15)直接在白色自旋过滤膜的中央加上50μL的洗脱液―C‖.

16)30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

17)移去并丢弃自旋过滤器.收集管中的洗脱液现在是纯化DNA,可以立即分析或储存在-20°C.

1.3.3.1MSP定性分析cTnI上游CpG岛及启动子关键元件散在CG位点DNA甲基化水平

(1)各组小鼠心肌组织DNA提取

1)预冷匀浆器EP管架,方法同前;

2)各组心肌组织低温匀浆,操作同前;

3)每管中加入GA缓冲液200µl,快速震荡至组织悬浮与溶液中;

4)加入20µl蛋白酶K,震荡摇匀,56℃水浴约4小时至组织完全溶解,期间每小时震荡混匀一次;

5)加入GB缓冲液200µl,震荡混匀,70℃水浴10分钟,可见液体清亮;

6)加入100%乙醇200µl,快速震荡20秒,贴壁离心30秒;

7)将6步EP管中内容物转移至新吸附柱CB3内,吸附柱置于收集EP管内,12000rpm离心1分钟,弃滤液;

8)CB3中加入GD缓冲液500µl;

9)漂洗液PW600µl加入吸附柱中底部,离心1min,12000rpm,弃滤液,将吸附柱放回EP管中;

10)重复前一漂洗步骤;

11)吸附柱置于新EP管中室温下放置3分钟,以晾干漂洗液,避免其影响下游反应;

12)向吸附柱CB3中间底部部位加TE洗脱缓冲液100µl,室温下静置2分钟,离心2分钟,12000rpm,所得滤下的液体即为提取所得DNA溶液,DNA样本测定浓度后-20°保存。

1.3.3.3亚硫酸盐处理DNA样品

(1)DNA样品室温放置复温;

(2)取出消毒后200µlEP管,按下表逐一加入各化学组份:

试剂用量(µl)

DNA样品(总量不超过2µg)适量(最大不超过20µl)

RNase-freewater补足140µl

BisulfiteSolution85

DNAProtectBuffer35

Totalvolume140

(3)将上一步EP管内溶液平均分装在两个EP管内,利用PCR仪进行如下

反应:

步骤时间温度

变性5min95℃

孵育20min60℃

变性5min95℃

孵育20min60℃

(4)反应结束后将两管液体重新合并转移如1.5mlEP管内;

(5)每组EP管内加入BL缓冲液310µl,震荡混匀,贴壁离心;

(6)每组EP管内加入100%乙醇250µl,快速震荡摇匀,贴壁离心;

(7)取出DNAMiinElute离心柱及收集管,离心柱放在收集管内,随后将6步中的液体加入离心柱中,;

(8)加入BW缓冲液500µl,离心1min,14000rpm,弃滤过废液;

(9)加入500µlBD缓冲液,室温下孵育10-15分钟,离心1min,14000rpm,弃滤过废液;

(10)重复8步2次;

(11)加入100%乙醇250µl,离心1min,14000rpm,弃滤过废液;

(12)将离心柱放入新的2mlEP管中,离心1min,14000rpm,弃滤过废液;

(13)离心柱室温下放置5分钟,晾干内部液体;

(14)将离心柱放入新1.5ml消毒后EP管中,加入15µlEB缓冲液,室温静置反应1min,离心1min,14000rpm,所得滤过液体即为亚硫酸盐处理后DNA,样品于-20℃保存。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm