衰老期小鼠心脏舒张功能障碍中cTnI基因低表达的表观遗传机理研究

关键词：衰老期 小鼠 心脏舒张功能障碍 cTnI基因 遗传机理 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

（1）DNA与蛋白交联

1）选取各组心脏组织，新生选取5-6颗心脏，2w选取2颗，其余各组均选1颗心脏。各组心脏组织放于1.5mlEP管中，利用眼科剪将组织剪碎，约1mm3大小即可；

2）将剪碎的组织转移入15ml锥形离心管内，加入9ml预冷的PBS，摇匀；

3）每个锥形管中加入275ul浓度为37%的甲醛，摇匀，室温下反应约10分钟，待组织中DNA与蛋白充分交联；

4）每管中加入10×甘氨酸1ml，混匀，室温下反应10分钟，以终止交联；

5）配制洗涤液，1ug/ml蛋白酶抑制剂：10ml预冷PBS；

6）将4部锥形管4°3000rpm离心2分钟，弃上清，利用5部洗涤液对沉淀物进行漂洗，反复3次后弃上清，将沉淀组织转移入1.5mlEP管中。

（2）超声切割DNA

1）配制超声切割用裂解液，200ulSDSLysinebuffer加2ul蛋白酶抑制剂（可保证20mg左右心脏组织裂解）；

2）利用超声破碎仪，将含有各组心肌组织的EP管放入超声切割架上，注意若有空缺应用空EP管予以补充，选取中频，4°低温切割30分钟左右；

3）吸取超声切割后的DNA溶液2ul，进行琼脂糖电泳，观察DNA切割情况是否满意，下图为理想情况，即DNA片段主要分布于200-1000bp；

（3）交联Protein/DNA的免疫共沉淀(IP)

1）配制IP反应液。•每组IP需要900μL稀释液与4.5μL的蛋白酶抑制剂II.

•免疫共沉淀应包括阳性对照(Anti-RNA聚合酶II),与阴性对照(普通小鼠IgG),与目标抗体(使用者自备).建议用户使用与目标抗体同种属的阴性对照IgG.

2）准备数个装有100μL打断的交联染色质的EP管放在冰上来完成所需数量的免疫共沉淀.•如果多个免疫共沉淀都将用相同制备的染色质来完成,那就将所需数量的免疫共沉淀整个放入一个大型管中,它将能够为每次IP容纳1.1mL.

3）每个EP管中加入1）部配制的IP反应液和100ul超声切割后DNA。

4）将60ul琼脂糖蛋白G加入EP管中（总体积的50%），在移液之前轻柔的旋转来使其混合。

5）放在摇床上4°C孵育1小时.

6）对颗粒琼脂糖进行简短离心(3000-5000xgfor1min).•不可高速旋转蛋白G琼脂糖珠.用力过度g-force可能使珠子粉碎或变形并使颗粒不一致.

7）取出10μL(1%)上清液作为input并4°C保存直到SectionD,step1.•如果不同的染色质制剂通过这个原始记录在一起被执行,从每一组中移去1%的染色质作为input.

8）收集上清液并且分发1mL等量试剂到每一个干净的离心管.丢弃琼脂糖颗粒.

9）将免疫共沉淀的抗体加入上清液部分:•anti-RNA聚合酶作为阳性对照，每管中加入1.0μg抗体.

•正常小鼠IgG作为阴性对照，每管中加入1.0μg抗体.

•对于用户提供的抗体与控制器,在每管中加入1-10μg的抗体.抗体的恰当数量需要由经验来确定.

10）在4°C下旋转孵育过夜.

11）在每一个IP中加入60μL的蛋白G琼脂糖,并在4°C下旋转孵育1小时.

12）蛋白G琼脂糖颗粒经过短暂的离心后(3000-5000xg,1minute)移去上清液部分.

13）用每种冷冻缓冲液1mL(成分如下所列)洗涤蛋白G琼脂糖-抗体/染色质复合体使颗粒悬浮,在摇床上孵化3-5分钟之后经过短暂的离心(3000-5000xg,1minute)再小心的丢弃上清液部分:a.低盐免疫复合物洗涤液(Catalog#20-154)，洗涤一次

b.高盐免疫复合物洗涤液(Catalog#20-155),洗涤一次

c.氯化锂免疫复合物洗涤液(Catalog#20-156),洗涤一次

d.TE缓冲液(Catalog#20-157),洗涤两次

（4）蛋白/DNA复合物的洗提

1）为所有的IP管与所有input管准备洗脱液.•为每一管准备200μL的洗脱液:10μL20%SDS,20μL1MNaHCO3与170μL无菌蒸馏水.

2）同样INPUT各组也需加入200ul洗脱液.

3）先加入100ul洗脱液在IP管中.

5）室温下孵化15分钟.

6）琼脂糖颗粒经过短暂离心后(3000-5000xgfor1minute)收集上清液到新的离心管中.

7）重复steps4-6且使洗出液结合(总容积=200μL).

（5）Protein/DNA复合物逆转交联为游离DNA

1）在所有管子中(IPs与input)加入8μL5MNaCl,且在65°C下孵育4-5h,使DNA–蛋白交联逆转.在这一步后样本可被储存于-20°C,在第二天再继续原始记录.

2）在所有管子中加入1μL的RNaseA且在37°C下孵化30分钟.

3）在每管中加入4μL0.5MEDTA,8μL1MTris-HCl与1μL蛋白酶K在45°C下孵化1-2小时.（6）用旋转柱使DNA纯化

1）从来自SectionE的每一个样本管中,去掉一个集合管的自旋过滤器与一个单独收集管.

2）加入1mL的粘合剂―A‖到每个200μLDNA样本管并完全混合.•每1个体积的样本应加入5个体积的粘合剂―A‖.

•可能会出现沉淀物.这不会影响此步.

3）转移600μL的样本/粘合剂―A‖混合物到采集管的旋转过滤器中.

4）30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

5）从采集管上取下旋转过滤器,保存采集管并弃去液体.•如果在Step2形成了沉淀物,有可能会出现在采集管的底部,但不影响此步.

6）将旋转过滤器放回到同一个采集管中.

7）转移从Step2余下的600μL的样本/粘合剂―A‖混合物到旋转过滤器并重复steps4-6.

8）加入500μL的洗涤剂―B‖到采集管的旋转过滤器中.

9）30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

10）从采集管上取下旋转过滤器,保存采集管并弃去液体.

11）将空余的旋转过滤器放回到同一个采集管中.

12）30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

13）丢弃采集管与液体.

14）将旋转过滤器放入一个干净的采集管.

15）直接在白色自旋过滤膜的中央加上50μL的洗脱液―C‖.

16）30秒离心,至少10,000但不超过15,000xg.

17）移去并丢弃自旋过滤器.收集管中的洗脱液现在是纯化DNA,可以立即分析或储存在-20°C.

1.3.3.1MSP定性分析cTnI上游CpG岛及启动子关键元件散在CG位点DNA甲基化水平

（1）各组小鼠心肌组织DNA提取

1)预冷匀浆器EP管架，方法同前；

2)各组心肌组织低温匀浆，操作同前；

3)每管中加入GA缓冲液200µl，快速震荡至组织悬浮与溶液中；

4)加入20µl蛋白酶K，震荡摇匀，56℃水浴约4小时至组织完全溶解，期间每小时震荡混匀一次；

5)加入GB缓冲液200µl，震荡混匀，70℃水浴10分钟，可见液体清亮；

6)加入100%乙醇200µl，快速震荡20秒，贴壁离心30秒；

7)将6步EP管中内容物转移至新吸附柱CB3内，吸附柱置于收集EP管内，12000rpm离心1分钟，弃滤液；

8)CB3中加入GD缓冲液500µl；

9）漂洗液PW600µl加入吸附柱中底部，离心1min，12000rpm，弃滤液，将吸附柱放回EP管中；

10）重复前一漂洗步骤；

11）吸附柱置于新EP管中室温下放置3分钟，以晾干漂洗液，避免其影响下游反应；

12）向吸附柱CB3中间底部部位加TE洗脱缓冲液100µl，室温下静置2分钟，离心2分钟，12000rpm，所得滤下的液体即为提取所得DNA溶液，DNA样本测定浓度后-20°保存。

1.3.3.3亚硫酸盐处理DNA样品

（1）DNA样品室温放置复温；

（2）取出消毒后200µlEP管，按下表逐一加入各化学组份：

试剂用量(µl)

DNA样品（总量不超过2µg）适量（最大不超过20µl）

RNase-freewater补足140µl

BisulfiteSolution85

DNAProtectBuffer35

Totalvolume140

（3）将上一步EP管内溶液平均分装在两个EP管内，利用PCR仪进行如下

反应：

步骤时间温度

变性5min95℃

孵育20min60℃

变性5min95℃

孵育20min60℃

（4）反应结束后将两管液体重新合并转移如1.5mlEP管内；

（5）每组EP管内加入BL缓冲液310µl，震荡混匀，贴壁离心；

（6）每组EP管内加入100%乙醇250µl，快速震荡摇匀，贴壁离心；

（7）取出DNAMiinElute离心柱及收集管，离心柱放在收集管内，随后将6步中的液体加入离心柱中，；

（8）加入BW缓冲液500µl，离心1min，14000rpm，弃滤过废液；

（9）加入500µlBD缓冲液，室温下孵育10-15分钟，离心1min，14000rpm，弃滤过废液；

（10）重复8步2次；

（11）加入100%乙醇250µl，离心1min，14000rpm，弃滤过废液；

（12）将离心柱放入新的2mlEP管中，离心1min，14000rpm，弃滤过废液；

（13）离心柱室温下放置5分钟，晾干内部液体；

（14）将离心柱放入新1.5ml消毒后EP管中，加入15µlEB缓冲液，室温静置反应1min，离心1min，14000rpm，所得滤过液体即为亚硫酸盐处理后DNA，样品于-20℃保存。

实验所需耗材：