关键词:小鼠 心脏 cTnI基因 衰老期 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

1.3.3.1心脏组织RNA提取

(1)将组织匀浆器EP管架放入-80℃冰箱预冷1小时以上;(2)剪去大小约4mm3心脏标本放入1.5mlRNasefree的EP管中,用眼科剪将组织剪碎,每个EP管中加入3颗匀浆器适配的碾磨钢珠,随后加入1mlRNA裂解液;立刻将EP管放入预冷的匀浆容器EP管架中,50次/秒震速,震荡匀浆5-8分钟,冰上静置2分钟,4℃12000rpm离心10min,将上清转移至新RNasefreeEP管中,弃去沉渣;

(3)每EP管中加入氯仿200µl,颠倒振荡混匀15s,室温孵育2-3min;

(4)4℃12000rpm离心10min后可见样品分为三层:上层无色水相即含有RNA、中间层及下层有机相,小心吸取后转移至RNasefree的EP管中;

(5)每EP管中加入等倍体积70%乙醇,颠倒混匀,随即转移入RA吸附柱中;

(6)4℃10000rpm离心45s,弃虑下废液,将吸附柱再次放回EP管中;

(7)500µl去蛋白液RE,4℃12000rpm离心1min,弃虑下废液;

(8)700µl漂洗液RW,4℃12000rpm离心1min,弃虑下废液;

(9)再次500µl漂洗液RW,4℃12000rpm离心1min,弃虑下废液;

(10)12000rpm离心2min,以完全去除漂洗液;

(11)取出RA吸附柱,放在新的RNasefree灭菌EP管中,加50-70µlRNasefree水在RA吸附柱中心部位,室温放置2分钟,低温12000rpm离心2min,所得虑下液体即为RNA。-80°冻存。

1.3.4Westernblot检测各组心脏中cTnI蛋白表达水平

1.3.4.1小鼠心肌组织全蛋白提取

(1)将组织低温匀浆器EP管架放于-80℃低温预冷至少1小时;(2)取5-7mm3小鼠心室组织,新生取3颗心脏,在1.5mlEP管中剪碎,每个EP中放3颗匀浆器适配的碾磨钢珠,加入100µlPBS溶液,并将EP管放入预冷的匀浆容器管巢中;

(3)准备Buffer裂解液:1ml裂解液中加入1µl蛋白酶抑制剂、10µl磷酸酶抑制剂及5µl100mM的PMSF,摇匀后置于冰上;每个EP管仲加入100-200ul配制好的裂解液,最大匀浆速度震荡8min,冰山静置,反应10分钟。

(4)4度低温12000rpm离心,将上清液转移至新的EP管仲,弃沉渣,所得上清即为全蛋吧溶液。立即进行蛋白浓度测定,并将蛋白-80℃低温保存。

1.3.4.2蛋白样品浓度测定

(1)按照50(A):1(B)的比例配制BCA工作液。将试剂盒配有的标准品液体稀释为6个浓度梯度;用ddH2O将前一步所得蛋白样品稀释5倍;

(2)将200µlBCA工作液依次加入标准曲线绘制组及待测样品组各孔,标准曲线绘制组孔内加入25µl稀释后各浓度梯度的标准品,待测样本组加入25µl蛋白样品稀释液;

(3)37℃孵育30分钟,即在酶标仪上进行OD值读数;

(4)根据标准品各浓度梯度的OD值绘制标准曲线,将待测样本组OD值带入标准曲线并乘以5倍即为蛋白浓度(标准曲线应满足相关系数大于0.99)。

1.3.4.3Westernblot检测各组小鼠心脏cTnI及cTnT蛋白表达

(1)配制浓度为12%的SDS-PAGE分离凝胶:

1)准备50ml小烧杯2个,Bio-Rad配胶玻板一副;

2)用玻板架将玻板固定;按如下比例配制12%浓度SDS-PAGE分离胶液体约5ml,之后用无水乙醇封口(各组份比例为:ddH2O1.6ml,30%丙烯酰胺2ml,1.5MPh8.8Tirs1.3ml,10%SDS50ul,10%AP50ul,TMED2ul);

3)室温下待胶凝固(至少40分钟),观察分离胶凝固情况,将无水乙醇弃掉,室温晾干约5分钟,配制2ml5%SDS-PAGE浓缩胶(各组份比例为:ddH2O1.4ml,30%丙烯酰胺0.33ml,1.5MPh6.8Tirs0.25ml,10%SDS20ul,10%AP20ul,TMED2ul);

4)将配制好的5%浓缩胶加入分离胶上层,随即插入梳子;

5)室温放置1-2小时待胶充分凝固后即可进行后续实验。

(2)蛋白质凝胶电泳

1)将蛋白样本与loadingbuffer按4:1的比例混合,震荡混匀,100℃,6min使蛋白充分变性;

2)电泳槽内分别加入上槽及下槽电泳液。(注:上、下槽电泳液应超过加样梳上缘);

3)取出加样梳,第一孔道加入marker4ul,后用10ul加样枪依次加NB、2w、3m、10m及18m蛋白样品;

4)接通电源,设定电压60v,约30min浓缩胶电泳。待溴酚蓝电泳至浓缩胶与分离胶交界处时,更换电压120v,进行分离胶电泳,后约50分钟,待25-35marker部分分开约1cm时即可停止电泳。取出凝胶玻板,准备切胶;

5)切胶,利用刀片将15-35条带分离胶切下,并测量长宽,同时切下35-70条带,测量长宽,放置于三蒸水中;

(3)湿转

1)量取预先配置好的未加甲醇的5×湿转液200ml,依次加入600mlddH2O及200ml甲醇,配置成1×湿转液工作液;

2)按照如前切胶尺寸剪取PVDF膜,并将其放入甲醇中分化30s;

3)将电转液加入电泳槽中,由于蛋白带负电荷,因此安装黑色面由下至上依次放滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸及白色面,封闭好放入电泳槽中,黑色对负极,红色对阳极进行电转,电压设定为105v,电转时间60分钟;

(3)封闭

1)电转后,蛋白已转至PVDF膜上,将PVDF膜放入封闭液中,常温封闭1小时;(封闭液配制比例为100mlPBS,5g脱脂奶粉,50ul20%吐温)

(4)用封闭液封闭抗体:cTnI抗体以1:1000的比例稀释,cTnT按照1:1000比例稀释,β-actin按照1:2000比例稀释,均采用PE手套薄膜封成小袋,4℃摇床孵育14-16小时;

(5)取出PVDF膜封装的薄膜袋,室温复温30分钟,后取出PVDF膜,用PBST洗涤10分钟,反复洗涤3次;

(6)二抗孵育,用封闭液稀释二抗(1:3000),cTnI及cTnT均采用山羊抗兔,βactin采用山羊抗鼠,同样方法用薄膜封闭孵育,37度孵育1-2小时;

(7)再次洗膜,将PVDF膜在PBST中反复洗涤3次,每次10分钟。

(8)ECL化学发光法显色:

1)按照1(A):1(B)的比例配制显色液,注意避光摇匀;

2)将约400ulECL显色液均匀滴加在PVDF膜上,曝光显影。

(9)图像结果分析

以β-actin为内参,利用QuantityOne软件分析各组带灰度值,以cTnI及cTnT灰度值/β-actin灰度值来检测目的蛋白相对含量,重复三次意思进行统计学分析。

1.3.5透射电镜检测3m及18m小鼠心肌细胞超微结构

(1)标本准备

1)首先在重庆医科大学生命科学院电镜室领取4%戊二醛溶液,用于对电镜标本的固定;2)电镜对标本要求较高,标本必须为新鲜组织,大小1mm3左右,每个标本取样4-5个,部位选取左心室;3)标记好后送往生科院电镜室;

(2)超薄切片、染色及照片

后续步骤由电镜室老师完成,仅需预约看片时间,拷取电镜照片即可。

1.3.6.2组织脱水

(1)采取冰冻切片,因此仅用30%蔗糖溶液进行部分脱水,待组织完全下沉如蔗糖溶液底部即说明脱水完成。

1.3.6.3组织包埋

(1)利用冰冻切片机,将组织固定在包埋托盘上,冷冻后,滴胶水在组织表面,至组织完全被包围,胶水冷冻凝固后即完成包埋。

1.3.6.4组织切片

(1)为防止脱片,采用防脱片载破片;

(2)由成年心脏较大,过薄切片容易造成碎裂及褶皱,因此切片厚度选为10um;

(3)厚度调整为20um进行修片,充分暴露心脏四腔(四腔通常难以暴露在同一平面,但一般保证双心室及一侧心房);

(4)调换刀片的另一侧进行切片,厚度为10um;

(5)用载玻片贴片后固定于4%甲醛溶液中10分钟,然后将载玻片放置于60°

烤箱中充分烘干、固定,至少烘干4小时,以防治脱片;

1.3.6.5H&E染色

将烘干的载玻片取出,按下述步骤进行染色;(一)脱胶水

(1)由于没有用石蜡包埋,因此无需用二甲苯脱蜡直接放入梯度乙醇中除去胶水。(2)100%乙醇2分钟。(3)90%乙醇2分钟。(4)放80%乙醇2分钟。(5)70%乙醇2分钟。(6)自来水冲水3分钟。

(二)染色

(1)苏木素浸染5-8分钟;(2)自来水冲水5分钟;(3)1%盐酸酒精分化3-5s;(4)饱和碳酸锂反蓝3s;(5)自来水冲水2分钟(6)伊红染色40秒;(6)冲水1分钟。

(三)脱水

(1)80%乙醇2分钟;(2)90%乙醇2分钟;(3)100%乙醇2分钟。(四)玻片平摊、晾干(五)封固利用中性树胶进行封闭。常温保存切片。(六)光镜照片。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm