关键词:食管鳞癌 C-myc BubR1 紫杉醇 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

1.2方法

1.2.1免疫组化

(1)将二甲苯I/II预热至56°C左右,放置20min,完全预热,而后把标本片子依次放入二甲苯I/II中各20min来脱蜡。

(2)玻片依次放入浓度为100%--90%--80%--70%乙醇中(重水化),每个放置3min,而后流水缓缓冲洗5min,PBS浸洗3次,每次3min。

(3)使用3%H2O2封闭,玻片放入湿盒内37°C下孵育10min,PBS浸洗3次,每次3min。将片子置入塑料盒内并加满抗原回收缓冲液,高火煮沸,底火维持20min,室温下自然冷却。PBS浸洗3次,每次3min。

(4)稀释一抗,每张片子的用量约为50-100ul,放置于湿盒内,4°C下过夜。次日取出湿盒,37°C下复温1h。PBS浸洗3次,每次3min。

(5)按照说明书进行二抗孵育,PBS浸洗3次,每次3min。

(6)DAB显色,室温下3-5min,不断于镜下观察显色结果,需要时可以延长显色时间。流水冲洗,蒸馏水冲洗。

(7)复染为使用苏木精3min,流水冲洗,放入碳酸锂18s,盐酸酒精2s,碳酸锂再18s,镜下观察染色效果。

(8)酒精脱水为依次放置95%-99%-100%乙醇,每个放入3min。放入脱水二甲苯三个准备瓶中,每次5min。准备中性树胶和干净盖玻片,封片。至少等待48h干燥后镜下观察,照相,保存。

(9)镜下观察和计数阳性细胞着色比例,无着色的为阴性(-),阳性细胞占20-30%为阳性(+),阳性细胞占30%以上的并且棕色颗粒颜色较深的为中等阳性(++)。

1.2.3BubR1启动子报告质粒活性检测

(1)细胞准备:将每孔3×104个食管鳞癌细胞接种于24孔板,贴壁过夜。将预先培养的293细胞传代于10cm2平皿中,待细胞贴壁密度为80%左右,用Ad-C-Myc感染细胞,24h后观察荧光亮度达70%左右,消化细胞,以4×104个细胞/孔接种于24孔板,过夜贴壁。

(2)质粒转染:按说明书进行操作,将1μg质粒溶于50μl无血清培养基中,2.5μlLipofectamine2000溶于另一管50μl无血清培养基中,室温下静置5min。两管溶液轻柔混合,室温下放置20min。将细胞培养24孔板内培养基更换为无血清培养基,逐滴轻轻滴入质粒和Lipofectamine2000混合液,轻柔混合。孵育6h后更换培养基为含1%胎牛血清的培养基。

(3)碱性磷酸酶活性测定:细胞继续培养24h后,吸取上清液5μl加至20μl碱性磷酸酶底物缓冲液中,混匀,室温下避光1h,而后采用比色分析法检测碱性磷酸酶的活性。

1.2.4DAPI染色

(1)细胞分组:ECA-109细胞,加DMSO对照组,经50μM10058-F4处理组,经100nM紫杉醇处理组和10058-F4联合紫杉醇处理组。

(2)DAPI染色:对数生长期的细胞以1×105接种至6孔板内,过夜贴壁后分别加入DMSO药物溶剂对照,50uM10058-F4,100nM紫杉醇或同时加入10058-F4和紫杉醇。48h后,将板子离心后,小心洗去培养基,加入终浓度为10ug/ml的DAPI染液,避光染色10min。PBS清洗,紫外光下观察染色效果,计数,拍照。每组细胞至少计数300个。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm