关键词:BubR1 干扰腺病毒 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

(6)胶回收

使用Omega公司胶回收试剂盒,按照说明书进行操作。首先将跑好电泳PCR产物凝胶按相应大小切割下来,放在1.5mlEP管内称重,按1g琼脂糖块中加入1mlBindingBuffer,放在60℃水浴中7min,每隔2-3min混匀一次,直到完全融化成透亮。将700μl混合液上HiBindDNA过滤柱,于10000g室温下离心1min,弃去滤过后液体,再次加入等量体积混合液上柱,直到所有混合液都过柱。加入300μlBindingBuffer于柱子内,10000g下离心1min,弃去过滤液。加入700μlSPWBuffer洗涤柱子,静置2-3min后10000g下离心1min,重复此步骤一次。弃去过滤液,再次将柱子于10000g下离心1min除去残留过滤液体。将柱子放在一个干净的EP管内,加入30-50μlElutionBuffer于柱,10000g离心1min洗脱柱子上结合的DNA,测定胶回收后DNA浓度。

(7)片段纯化

使用Omega公司核酸纯化试剂盒,按照说明书进行操作。将胶回收产物转移至一个干净EP管中并加入其5倍体积的CPBuffer,完全混匀,短暂离心。将事先用平衡液活化的HiBindDNA纯化柱子准备好,将样品上柱,于室温下10000g离心1min。弃去过滤液,加入700μlDNAWashBuffer,室温下10000g离心1min,此步骤重复一次。弃去过滤液,将柱子在室温下13000g空离心2min来去除任何残留液体。加入20μlElutionBuffer上柱,室温下13000g离心1min,收集过滤液体,测定纯化后的DNA浓度。

(10)乙醇沉淀

用去离子水将连接产物稀释至200µl,加入20mg/ml糖原2.5µl,7.5mol/L乙酸铵100µl,700µl预冷无水乙醇,充分混匀后室温下13000g离心5min,小心弃去上清,加入500µl70%乙醇,13000g离心2min,重复此步骤一次,小心弃去上清,室温下干燥,加入30µl去离子水溶解连接产物。

(11)电转化感受态DH5α

吸取10µl的连接产物与感受态DH5α冰上混合后加入电转杯,1.8KV下电击,用LB稀释电转后细菌,铺含Kan的LB平板,37℃孵育过夜(15h左右)。

(13)质粒提取

将菌落PCR初筛鉴定正确的细菌放于37℃摇床内,180rpm下摇菌12-16h,直至菌液浑浊。按照Omega公司质粒提取试剂盒进行质粒提取。10000g离心每次1min,收集所有细菌,丢弃上清液。加入250μl含RNaseA的SolutionI,震荡混匀,完全重悬细菌。加入250μlSolutionII,轻柔的混合几次,直至液体变得清亮,可在室温下放置2min以达到更好的效果。加入350μlSolutionIII后立即颠倒混合直至出现白色絮状沉淀。室温下13000g离心10min,将上清液小心加入到HiBindDNA纯化柱,13000g离心1min,弃去过滤液,加入500μlHBBuffer来清洗柱子,室温下13000g离心1min。弃去过滤液,加入700μlDNAWashBuffer,室温下13000g离心1min。再次于室温下13000g离心柱子2min以去除残留的液体。最后加入50μlElutionBuffer来洗脱与柱子结合的DNA。NanoDrop1000测定质粒浓度。

1.2.3BubR1表达腺病毒和干扰BubR1腺病毒重组包装和扩增

(1)感受态BJ5183制备

1)从-80℃冰箱中取出一只冻存的BJ5183菌,放入5ml摇菌管中37℃下180rpm摇菌12h,直至菌液浑浊。

2)用1000ml锥形瓶,加入200ml含链霉素的LB培养液,将BJ5183细菌液体全部加入,37℃下230rpm摇菌,当菌液的OD550达0.6~0.8时取出。

3)立即置于冰上,不断轻摇瓶子,使全部菌液快速冷却,4℃下放置过夜。

4)冰上将细菌分装至50ml的离心管中,4℃下3900rpm离心30min。

5)弃去上清,加入与上清同体积的10%无菌甘油重悬,4℃下3900rpm离心30min。

6)弃去上清,加入适量10%甘油重悬,将所有管中的液体集中于一管中,体积为最初菌液体积的1/5,4℃下3900rpm离心30min。

7)弃上清,加入与上清等体积的10%甘油,4℃下3900rpm离心30min。

8)弃上清,加入上清1/4体积的10%的甘油,4℃下3900rpm离心20min。

9)弃上清,留下少许液体(以1L菌液留取2-3ml计算),轻轻吹打混匀,分装后储存于-80℃。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm