BubR1表达及干扰腺病毒的构建、鉴定和扩增

关键词：BubR1 干扰腺病毒 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

（6）胶回收

使用Omega公司胶回收试剂盒，按照说明书进行操作。首先将跑好电泳PCR产物凝胶按相应大小切割下来，放在1.5mlEP管内称重，按1g琼脂糖块中加入1mlBindingBuffer，放在60℃水浴中7min，每隔2-3min混匀一次，直到完全融化成透亮。将700μl混合液上HiBindDNA过滤柱，于10000g室温下离心1min，弃去滤过后液体，再次加入等量体积混合液上柱，直到所有混合液都过柱。加入300μlBindingBuffer于柱子内，10000g下离心1min，弃去过滤液。加入700μlSPWBuffer洗涤柱子，静置2-3min后10000g下离心1min，重复此步骤一次。弃去过滤液，再次将柱子于10000g下离心1min除去残留过滤液体。将柱子放在一个干净的EP管内，加入30-50μlElutionBuffer于柱，10000g离心1min洗脱柱子上结合的DNA，测定胶回收后DNA浓度。

（7）片段纯化

使用Omega公司核酸纯化试剂盒，按照说明书进行操作。将胶回收产物转移至一个干净EP管中并加入其5倍体积的CPBuffer，完全混匀，短暂离心。将事先用平衡液活化的HiBindDNA纯化柱子准备好，将样品上柱，于室温下10000g离心1min。弃去过滤液，加入700μlDNAWashBuffer，室温下10000g离心1min，此步骤重复一次。弃去过滤液，将柱子在室温下13000g空离心2min来去除任何残留液体。加入20μlElutionBuffer上柱，室温下13000g离心1min，收集过滤液体，测定纯化后的DNA浓度。

（10）乙醇沉淀

用去离子水将连接产物稀释至200µl，加入20mg/ml糖原2.5µl，7.5mol/L乙酸铵100µl，700µl预冷无水乙醇，充分混匀后室温下13000g离心5min，小心弃去上清，加入500µl70%乙醇，13000g离心2min，重复此步骤一次，小心弃去上清，室温下干燥，加入30µl去离子水溶解连接产物。

（11）电转化感受态DH5α

吸取10µl的连接产物与感受态DH5α冰上混合后加入电转杯，1.8KV下电击，用LB稀释电转后细菌，铺含Kan的LB平板，37℃孵育过夜（15h左右）。

（13）质粒提取

将菌落PCR初筛鉴定正确的细菌放于37℃摇床内，180rpm下摇菌12-16h，直至菌液浑浊。按照Omega公司质粒提取试剂盒进行质粒提取。10000g离心每次1min，收集所有细菌，丢弃上清液。加入250μl含RNaseA的SolutionI，震荡混匀，完全重悬细菌。加入250μlSolutionII，轻柔的混合几次，直至液体变得清亮，可在室温下放置2min以达到更好的效果。加入350μlSolutionIII后立即颠倒混合直至出现白色絮状沉淀。室温下13000g离心10min，将上清液小心加入到HiBindDNA纯化柱，13000g离心1min，弃去过滤液，加入500μlHBBuffer来清洗柱子，室温下13000g离心1min。弃去过滤液，加入700μlDNAWashBuffer，室温下13000g离心1min。再次于室温下13000g离心柱子2min以去除残留的液体。最后加入50μlElutionBuffer来洗脱与柱子结合的DNA。NanoDrop1000测定质粒浓度。

1.2.3BubR1表达腺病毒和干扰BubR1腺病毒重组包装和扩增

（1）感受态BJ5183制备

1）从-80℃冰箱中取出一只冻存的BJ5183菌，放入5ml摇菌管中37℃下180rpm摇菌12h，直至菌液浑浊。

2）用1000ml锥形瓶，加入200ml含链霉素的LB培养液，将BJ5183细菌液体全部加入，37℃下230rpm摇菌，当菌液的OD550达0.6~0.8时取出。

3）立即置于冰上，不断轻摇瓶子，使全部菌液快速冷却，4℃下放置过夜。

4）冰上将细菌分装至50ml的离心管中，4℃下3900rpm离心30min。

5）弃去上清，加入与上清同体积的10%无菌甘油重悬，4℃下3900rpm离心30min。

6）弃去上清，加入适量10%甘油重悬，将所有管中的液体集中于一管中，体积为最初菌液体积的1/5，4℃下3900rpm离心30min。

7）弃上清，加入与上清等体积的10%甘油，4℃下3900rpm离心30min。

8）弃上清，加入上清1/4体积的10%的甘油，4℃下3900rpm离心20min。

9）弃上清，留下少许液体（以1L菌液留取2-3ml计算），轻轻吹打混匀，分装后储存于-80℃。

实验所需耗材：