ACK1在子痫前期发病机制中的作用

关键词:ACK1 子痫前期 发病机制 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

2.5IF检测H/R处理后ACK1在两种细胞中的表达

分别给予H/R及LY294002处理,分别检测HTR8/Svneo细胞和HUVEC细胞中给予H/R处理后ACK1的表达情况。(1)物品和细胞准备:把无菌盖玻片置于6孔板当中,每孔数量为3-5片。用胰酶对细胞进行消化后,将对照组及处理组HTR8/SVneo和HUVEC细胞加入培养基后进行重悬,使用细胞计数仪计数(l-2×105个)后铺板于6孔板中。预先将甲醇放入4℃冰箱预冷。(2)洗涤:细胞常规培养48h后,用移液器小心沿孔板边缘将培养起吸去,用无菌PBS轻轻冲洗玻片,5min×3次。(3)细胞固定:每孔内加入1ml预先已预冷好的冰甲醇固定细胞爬片一刻钟,利用无菌PBS对玻片进行冲洗,5min×3次。(4)封闭处理:将固定好的盖玻片放于载玻片上(注意分清楚正反面,覆盖有细胞,6孔板内向上的即为正面,正面超上),置于湿盒内,用免疫组化笔在盖玻片周围画出适当范围的圈,在圈内滴加少量的山羊血清封闭,在37℃恒温箱当中孵育0.5h。(5)孵育一抗:在完成封闭的情况下,用移液枪将封闭液移除(注意不要吸取到细胞),随即滴加一抗(多克隆ACK1兔抗人抗体,1:100),充分覆盖孵育。同时设定进行阴性对照(更换一抗为兔非免疫血清),置于4℃冰箱内孵育过夜。(6)孵育完成后,用移液枪回收一抗(注意不要吸取细胞),PBS冲洗玻片3次,滴加少量二抗(FITC-山羊抗兔二抗,1:100)。注意所有抗体滴加的量均以完全覆盖该玻片但液体不流动为宜。7℃恒温箱孵育1h,使用PBS对玻片冲洗3次。(7)染核:使用DAPI数滴滴加在盖玻片上,避光孵育8min,PBS冲洗细胞爬片,每次5min,共重复3次。(8)封片:使用50%甘油进行封片,使用显微镜进行观察分析。(9)图像的获取:DAPI细胞核染色成蓝色,ACK1蛋白阳性染色成绿色荧光标记。

2.6FCM法检测各组细胞凋亡

2.7.2.3SDS-PAGE电泳

(1)用物准备:自来水清洗玻璃板,用酒精擦拭后晾干。准备干净的电泳槽,PAGE胶固定夹子。(2)分离胶的制备:制备6%的分离胶,将配置好的分离胶液体沿固定好的玻璃板夹层缝隙轻柔倒入,不可倒得过满,最好不要产生气泡,距离上线0.8cm处停止。然后再用无水乙醇压胶。(3)浓缩胶的制备:检查无明显漏胶现象,等待分离胶凝固后,水-胶之间出现一条折线,倒尽无水乙醇后,依照(2)的方法灌入5%的浓缩胶,插入事先洗好晾干的梳子。待浓缩胶凝固后轻柔拔出梳子。(4)蛋白样品准备:从-20℃冰箱取出蛋白样品,于65℃水浴锅中加热5min,加热后置于离心机中瞬离。上样前用移液器混匀。(5)上样:把胶板置于电泳槽当中,每块胶的第一泳道进行5ul彩色预染的Marker的添加,把准备好的蛋白样品20ul(总蛋白量是40ug,蛋白浓度是2ug/ul)添加到相应的泳道当中。(6)电泳:保证电泳槽以及玻璃板安装正确,接通电源,将电泳电压设定成100V恒压,在溴酚蓝标记都跑出浓缩胶来到分离胶的情况下,将电压设定成120V,在溴酚蓝标记跑到分离胶底部的情况下,切断电源。(7)切胶:将玻璃板取出,放入预先放置于4℃冰箱预冷的电转液中,用起胶板轻柔的将两层玻璃板撬开(起胶时Marker位于左边),只切去浓缩胶和溴酚蓝标记以下和无用凝胶,采用全膜转的方式。

2.7.2.4转膜

(1)根据分离胶的大小裁剪合适尺寸的PVDF膜(与胶一样大)和滤纸(边缘超出胶的边缘约0.5cm),使用铅笔进行标记,在甲醇当中进行浸泡,把凝胶、滤纸以及PVDF膜置于电转液当中,平衡五分钟。(2)“三明治”的制作:依据相关规定和要求进行:在正极板至负极板依次为纤维板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-纤维板,保证平整,避免产生气泡,动作轻柔,避免揉碎胶。(3)电转(恒流):将电转槽放入4℃恒温冰箱内,通电后用250mA恒流电转120min。

2.7.2.5封闭

电转完成后,轻柔取下PVDF膜,分好正反面(紧邻胶面为正面),做好标记,放入预先装好适量TBST的抗体孵育盒内,摇床上震荡清洗5minX3次。弃去洗涤液,加入20ml已配置好的5%脱脂奶粉溶液,将抗体孵育盒置于摇床上,轻柔摇荡,封闭2h。

2.7.2.6孵育抗体

(1)洗涤:封闭完成后,将封闭液弃去,加入适量TBST溶液于摇床上轻柔摇荡洗涤5minX3次。(2)稀释抗体:用抗体稀释液将ACK1兔多克隆抗体稀释浓度为1:500,pPI3K、Akt抗体、p-Akt(Ser473)抗体、p-mTOR(Ser2481)抗体、mTOR抗体、VEGFR2抗体稀释浓度均为1:1000,β-actin稀释浓度为1:1000,把膜正面朝下放入抗体孵育盒,加入稀释好的一抗,4℃冰箱孵育过夜;(3)复温和回收一抗:将一抗溶液重新回收放入-20℃冰箱保存,将膜置于摇床上洗涤10minX3次。(4)孵育二抗:用抗体稀释液将HRP标记鼠/兔二抗(1:5000)进行稀释,室温孵育60min后用TBST清洗10minX3次。

2.7.2.7结果照相

按照说明书将ECL化学发光试剂盒中A、B试剂按照1:1比例混合后,滴加并完全覆盖PVDF膜表面,使用Bio-Rad成像系统显影,获得图片使用ChemiDocimageanalyze分析软件分析。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm