ACK1调节HTR8/Svneo细胞和HUVECs的生物学功能

关键词:ACK1 细胞 HUVECs 生物学 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

2实验方法

2.1ACK1shRNA转染HTR8/SVneo细胞和HUVECs

2.1.1构建敲降ACK1表达的shRNA慢病毒

通过阅读文献[9],从中得到能有效敲降ACK1表达的靶序列:5’-GTACCTGCTTCTTCCAGAGAA-3’,

ScrambledshRNA序列(shNC):5’TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。该实验当中的慢病毒载体为:阴性对照shRNA(滴度1x109TU/ml,shNC)以及ACK1shRNA干扰(滴度1x109TU/ml,ACK1shRNA)。

2.1.2慢病毒感染HTR8/SVneo和HUVECs

(1)细胞准备:HTR8/Svneo细胞培养于37℃,5%CO2,20%O2完全培养基(10%FBS,90%RPMI1640)中,取24孔板,每孔加入0.5ml完全培养基,待到细胞生长至对数生长期时,使用胰酶消化后,在37℃温度条件的培养箱当中进

行培养。(2)稀释慢病毒:借助于RPMI1640完全培养基对其进行稀释处理;(3)进行Step2稀释得到的病毒液的添加,为获得适宜的MOI值,我们建立感染复数值梯度,从低往高依次是20,50,80;转染sh-NC进行阴性对照的构建,在常规条件进行培养;(4)培养24小时后,将存在慢病毒的细胞培养液去除,进行完全培养基的更换,然后,再次进行培养;(5)在感染72h以及48h的情况下,通过荧光显微镜对HTR8/Svneo细胞的荧光强度以及生长状态进行观察,选择适宜的MOI值是50,该MOI下细胞状态稳定,未出现大片死亡的现象,且绿色荧光较强。据公式MOI值=病毒滴度x所需病毒体积/细胞数得知所需加入病毒溶液的体积;(6在培养五到六天以后,培养基内加入嘌呤霉素以筛选稳定转染细胞株。后续实验使用WB和PCR验证敲降效率。

2.2细胞增殖的检测(CCK8法)

(1)N组、sh-NC和shACK1组细胞分别消化后使用PBS使细胞重悬,并使用细胞计数仪细胞计数;(2)分别调整细胞浓度为3×104个/ml;(3)取1个96孔板,每组细胞接种5个孔,每孔接种100μl细胞悬液(即每孔细胞数为3000个),放细胞培养箱培养24h后开始进行检测;(4)1d时间点检测,吸去孔内培养基,每孔加入90μl完全培养基和10μlCCK-8,再加3个空白对照孔,放细胞培养箱孵育2h后检测450nm处吸光度值,检测完后换去孔内培养基将平板放培养箱继续培养用于后面时间点检测;(5)2d、3d…7d时间点检测,方法同前;

2.3细胞凋亡的检测

(1)N组、sh-NC、shACK1组细胞分别消化后并进行细胞计数;注:消化使用不含EDTA的胰酶。(2)N组细胞取2管,每管2×105个细胞;sh-NC组、shACK1组取1管,每管2×105个细胞;(3)1000rpm离心5min后弃上清,各加入500μl预冷PBS重悬细胞后再次1000rpm离心5min;(4)弃上清后各加入100μl1×Buffer重悬细胞,每组各取1管加入5μlAnnexinV-PE,并轻轻混匀,4℃孵育15min;(5)加入10ul7-AAD避光孵育15min,并上机检测;

2.4Transwell小室观察细胞迁移和侵袭功能的变化

(1)准备细胞:获取生长状态良好的细胞(HTR8/Svneo细胞及HUVECs)各组细胞分别消化后,1000rpm离心5min,弃上清,加入5ml无血清RPMI1640培养基重悬细胞并再次1000rpm离心5min,将上清去除,再次用RPMI1640重悬细胞计数,根据计数结果稀释细胞为2X104个/ml;(2)细胞迁移实验:取24孔板,放入3个细胞小室,每个细胞小室加入对照组和转染后的细胞悬液(HTR8/Svneo细胞及HUVECs)100μl(即每孔细胞数为2×103个);下室加500μl完全培养基(10%FBS+90%RPMI1640),连续常规培养48h,完成染色和固定。实验重复3次。(3)细胞固定染色:PBS浸泡洗涤2次,用预冷的80%甲醇固定25min,PBS浸泡洗涤2次,伊红染色2min(或结晶紫染色5min),PBS快速洗涤;取出小室放入盛有1mlPBS的24孔板中,用棉签将小室内没有穿过去的细胞擦去;倒置显微镜下随机取6个视野照相、计数(100倍),取平均数进行统计分析。(4)滋养细胞侵袭实验:实验操作基本同细胞迁移,不同之处是进行侵袭实验前需提前给予小室内铺胶,铺胶方法如下:所有操作均需无菌操作:-20℃保存Matrigel胶在4℃冰箱过夜融化;在冰上用预冷的枪头吸取80μlMatrigel胶加入冰预冷的320μl无血清1640培养基中,充分混均;取8个细胞小室放入24孔板中,取稀释的Matrigel胶50μl加入细胞小室上室,覆盖整个聚碳酯膜,37℃,30min,取出培养板,将小室四周多余的稀释Matrigel胶吸掉,再放入37℃使Matrigel胶聚合成胶备用;进行侵袭实验完成后染色步骤如(3)。实验重复3次。

2.5HUVECs管腔成型实验

(1)Matrigel胶的准备:Matrigel胶提前放在4℃的冰箱预融化过夜,稀释Matrigel胶时采用1:1比例无FBS培养基稀释。(2)铺胶:计算所需孔数n,每孔需Matrigel胶50μl。把Matrigel胶铺在无菌96孔板的底面,防止气泡的出现。(3)完成铺胶后,96孔板表面酒精消毒后放入培养箱中等待BD胶凝固。(4)N组及sh-ACK1组细胞,使用细胞计数仪进行计数。(5)用胰酶消化细胞30s-1min后,1000rpmx5min离心后用PBS再对细胞进行重悬,完成各组细胞(1.0×104个)的接种,加500μl完全培养基(10%FBS+90%RPMI1640)。(6)常规培养或缺氧复氧培养48h后使用显微镜进行观察管样结构成型情况及长度,试验结果使用ImageJ测定。

2.6qRT-PCR检测ACK1mRNA在HTR8/Svneo细胞及HUVECs中的表达

2.6.1合成引物

ACK1mRNA引物的合成同前一部分。

2.6.2提取细胞总RNA

(1)获取长势理想的已经长满T25培养瓶的sh-NC和sh-ACK1细胞,并预先准备好冰盒。(2)弃去上清液,用无菌PBS2ml轻柔冲洗培养瓶底部,3次,弃去清洗液,用移液器吸干PBS;(3)加入TRIzol1ml,轻微振荡培养瓶,使TRIzol均匀铺于瓶底,冰上静置10min;(4)静置时间到后,用移液枪反复吹打瓶底,使裂解的细胞液与瓶底脱落,见细胞裂解液变浑浊,可呈胶冻样;(5)移出细胞裂解液于1.5ml无酶EP管中,冰面上静置5min使细胞充分裂解;(6)进行200ul氯仿的添加,混合均匀,在冰面上静置五分钟,直到液体分层;(7)将EP管放入4℃离心机,1200rpm,15min离心,见液体由上至下分为上清液,蛋白质层,杂质层,使用移液器小心吸取上清液约300ul于另一无酶EP管中(切不可吸到蛋白层或杂质层)(8)加入等量的异丙醇(300ul),轻柔摇匀,静置10min后放置与4℃离心机中1200rpm,10min。(9)将上清液去除,存在白色沉淀,加入75%乙醇1ml,轻柔摇匀;再将EP管放入4℃离心机内,7500g,5min,弃去上清液,可见管底白色沉淀物;(10)于室温下干燥10-15min,仔细观察管底沉淀,当沉淀变为半透明后加入30ul的DEPC水,以移液枪轻柔吹打混匀;样本待测RNA浓度。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm