ACK1在人类胎盘发育过程中的表达

关键词:ACK1 胎盘发育 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

2实验方法

2.1免疫组化

2.1.1制备组织切片

将胎盘组织标本用石蜡进行包埋,使用轮转式切片机对其连续切片,注意切片厚度需在5μm左右。

2.1.2组织免疫组化步骤

(1)脱蜡:将已经切好的石蜡切片放置于预先预热好的65℃烘箱中,放置时间2h,随后将切片置于二甲苯中脱蜡两次:二甲苯I20min-二甲苯II20min。(2)水化:将脱蜡后的切片放置在酒精当中实施梯度酒精水化:依次为100%酒精10min,95%酒精5min,80%酒精5min,75%酒精5min,水化完毕后依次使用蒸馏水和PBS轻柔冲洗切面表面5min。

(3)抗原修复:将切片淹没于枸橼酸溶液中,然后放入微波炉中,加热,在达到沸点之后切断电源,一刻钟以后再次加热到沸腾,冷却到室温。(4)利用PBS液对切片冲洗5min,重复3次。(5)将切片浸泡于3%H2O2溶液中,然后放至37℃恒温箱孵育10min,达到消除组织内源性过氧化物酶活性的目的。然后PBS冲洗切片3次。(6)封闭:将切片放置于湿盒中,然后将5%山羊血清小心的滴加在切片中的组织部分,然后将湿盒放置于预先加热好的37%恒温孵育箱封闭15-20min,甩去液体(不能用PBS冲洗)(7)孵育一抗:向切片中的组织部分滴加稀释后一抗:兔抗人ACK1(1:100),CK7(1:200),HLA-G(1:200)和CD31(1:200),阴性对照使用PBS替代。将湿盒放置于4℃恒温冰箱内,过夜。(8)孵育二抗:将湿盒取出冰箱后复温,滴加山羊抗兔二抗,37℃孵育30min,然后使用PBS冲洗5minX3次。(9)DAB显色:将DAB试剂滴在切片上的组织上,避光反应10min,自来水轻柔冲洗切片,停止反应。(10)染色:采用苏木精染色反应半分钟,使用自来水冲洗;(11)脱水:使用酒精浓度同(2),顺序相反,PBS清洗一次,持续10min;(12)透明:二甲苯I作用20min,二甲苯II作用20min。(13)使用中性树胶封片后放在通风橱当中,风干处理。

2.2.1提取胎盘组织蛋白

(1)蛋白样品的制备:将之前冻存的23例正常组胎盘组织和PE组胎盘组织,按照试剂盒说明书上标本的要求,用天平称取约100g组织洗涤干净,并用组织剪剪碎,同时,将其置于玻璃匀浆器中。(2)把1mllysisbuffer,1μl蛋白酶抑制剂,10μl磷酸酶抑制剂,5μl100mMPMSF置于玻璃匀浆器当中,在预先准备好的冰盒上进行匀浆,时间约20min。(3)匀浆完成后,将匀浆液移至预先准备好的离心管中,将离心管放入低温离心机,4℃12000rpm离心5min。(4)离心后取上清液,使用移液器时需避免吸入管底沉淀,不可贪多。上清液置于-20℃保存备用。

2.3qRT-PCR监测ACK1在胎盘组织中的表达

2.3.2组织中总RNA提取

(1)胎盘组织的匀浆:在-80℃冰箱中取出预先冷冻的胎盘组织块100mg,把组织置于匀浆器的底部,添加1.5mlTrizol,匀浆裂解。冰上低温匀浆0.5h。(2)匀浆完成后,观察匀浆器底部未见明显组织碎片后,将装有组织裂解溶液的离心管放入离心机中12,000rpm,4℃离心一刻钟。转移上清无色透明Trizol裂解产物到1.5ml无酶EP管里面(切不可吸取到离心管底部的沉淀),在室温环境条件下静置五分钟。(3)分离:将200ul氯仿加入EP管,上下颠倒混合均匀,充分反应,溶液变成淡粉红色,全面实现乳化,接下来,在室温环境条件下静置5min。(4)离心:EP管在4℃低温离心机内12000rpm,离心15min。然后用移液管将上层无色水相转移置新的1.5ml无酶EP管当中,总量在400μl左右。(5)将所获得的上清液,加入等量异丙醇(400ul),将其混合均匀,在室温环境条件下静置10min。(6)然后再次将EP置于低温离心机内,4℃条件下12000rpm,离心10min。(7)离心之后能够发现EP管底部存在白色沉淀,将上清去除。(8)将75%预冷的乙醇1ml添加到EP管当中,使用振荡器震荡处理,使其混匀。(9)然后将离心管放置于低温离心机内,4°C12000rpm,离心处理五分钟,将上清液去除,EP管在常温条件下干燥五min。(10)DEPC水,30μl添加,使RNA沉淀充分溶解。(11)RNA的浓度测定及保存:取2ul上述RNA溶液,使用NanoDrop2000检测RNA浓度与纯度,OD260nm/OD280nm比值在1.8-2.0之间,OD260nm/OD230nm比值>2.0时,RNA样品视为合格,方可进行后续实验。若RNA暂时不用,需置于-80℃冰箱中保存。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm