雷公藤甲素治疗肺纤维化的药理机制研究

关键词:雷公藤甲素 肺纤维化 药理机制 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

1.2实验方法

1.2.1细胞复苏及培养

(1)将冻存的细胞从液氮罐中取出,迅速将冻存管投入到37℃水浴锅中,快速摇动冻存管,使细胞尽快融化。在无菌生物安全柜中,将融化的细胞悬液吸到装有适量培养基的离心管中,800rpm离心5min;

(2)将上清液倒掉,用1mL完全培养基将细胞悬起,吸入到装有5mL培养基的细胞培养皿中,将细胞置于37℃、5%CO2,恒温恒湿的条件下培养。

(3)细胞汇合度达到80%-90%接触时开始进行传代。0.25%的胰酶消化成单细胞悬液,800rpm离心5分钟;弃上清,加1-2mL培养基悬浮细胞,将细胞传到2-3个培养皿中,继续扩增培养。

1.2.2划痕实验

(1)用胰蛋白酶将培养皿中贴壁生长的细胞消化成单个细胞;将细胞悬液接种于24孔板中,每孔接种细胞约1.0×106个,37℃、5%CO2培养箱中孵育24h;

(2)次日,用灭菌枪头在孔板底部划痕,并用PBS清洗孔内的细胞碎片以及未贴壁细胞。每组需要设置三个重复,加入不同浓度的雷公藤甲素,37度培养箱中培养;

(3)在加药后0、24、48h这三个时间点按时观察细胞,并采集细胞划痕图像。

1.2.3Transwell实验

(1)铺Matrigel:在4℃冰箱中预冷枪头、培养板、小室;将Matrigel置于4℃冰箱中使其融化。在冰上用无血清培养基按1:1~1:3的比例稀释Matrigel。在24孔板中放入Transwell小室,每个小室铺50μlMatrigel,防止气泡产生。铺好胶的孔板置于37℃中孵育20min,待其凝固。

(2)水化基底膜:配置含0.1%血清的培养基,每孔50μl培养基加于胶上,然后置于37℃培养箱中孵育30min后,弃去培养基。

(3)细胞消化后离心,用PBS重悬细胞,再次离心,弃上清,用含0.1%的FBS的培养基重悬细胞,将细胞稀释成2×105cells/mL,每个小室200μl的铺于Matrigel上。

(4)细胞置于37℃培养箱中培养36h。

(5)用棉签将小室上层的细胞和matrigel胶擦掉,小室放入-20℃预冷的甲醇中固定下层细胞5~10min。

(6)用PBS清洗下层细胞3次后,将小室放置于0.1%的结晶紫染色液中染色10min。

(7)用PBS清洗多余染色液,并置于显微镜下拍照分析下层细胞数量。

1.2.4扫描电镜观察样品制备

(1)细胞处理:将不同药物处理后的细胞铺在24孔板爬片上。

(2)细胞固定:配制预冷的2.5%戊二醛,并于4℃固定2h;用预冷的1%锇酸,4℃下固定1h,然后PBS浸洗。

a.2.5%戊二醛配制:用蒸馏水将50%的戊二醛稀释成5%后再用磷酸缓冲液(0.2M)稀释为终浓度为2.5%的戊二醛。

b.2%锇酸母液配制:在排毒柜内把装四氧化锇安瓿瓶敲破放入棕色试剂瓶中,立即加入双蒸馏水,配制成终浓度为2%的水溶液。盖上盖子后,静置1天或更长时间溶解。然后将培养液置于冰箱中密封保存。使用时2%锇酸母液和磷酸缓冲液(0.2M)1:1混匀配成1%锇酸工作液。

(3)细胞脱水:梯度乙醇脱水,用双蒸水配制30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精水溶液。正向梯度(由低到高)每次个浓度的酒精水溶液浸泡15min。

(4)细胞干燥:利用梯度叔丁醇干燥。配制30%、50%、70%、80%、90%、100%的叔丁醇溶液。利用正向梯度(由低到高)每次浸泡15min。最后用100%叔丁醇必须覆盖住整个爬片(细胞),可放置4℃保存过夜。

(5)真空干燥样品:将样品用封口膜封闭,并在封口膜上扎多个小孔利用气体流动,然后放置在冷冻干燥仪中(同样叔丁醇必须为固体并覆盖在样品上),抽干叔丁醇。

(6)离子溅射仪喷金:将爬片用导电胶带固定到圆柱托上,放入离子溅射仪中,开始抽真空。利用针阀将真空度保持在5-6Pa之间,确保电流在10mA左右,喷金。

(7)扫描电镜拍摄样品并观察。

1.2.5免疫荧光检测

(1)细胞爬片:将玻片置于24孔板中,待用。细胞消化,离心,用培养基重悬稀释至一定密度,细胞计数,在含玻片的孔板中铺入一定数量的细胞。细胞贴壁后进行相应药物处理。

(2)细胞固定:弃去培养基,用PBS清洗细胞一次后用预冷的甲醇室温固定细胞5min。

(3)再次用PBS清洗细胞,将残留的甲醇除去。

(4)封闭抗原:用PBS配制含5%血清的封闭液,室温封闭30min,若为细胞核或细胞质中的蛋白,封闭液中应加入TritonX100,终浓度为0.1%)。

(5)一抗孵育:用封闭液稀释一抗,室温或37℃孵育1h或者4℃过夜孵育。

(6)用PBS洗细胞3次

(7)二抗孵育:用封闭液稀释二抗(FITC及TRITC常用比例1:200),并与室温孵育30min~1h。然后用PBS清洗细胞4~5次。

(8)用含DAPI的封片剂封片,然后共聚焦显微镜观察,拍照。

1.2.6计算机模拟药物与TGF-b1蛋白的结合

从蛋白质数据网站PDB(http://www.rcsb.org/)中下载TGF-b1同源蛋白的晶体结构。用Swiss-model软件建模,再用EasyModeller验证建模可靠性。用Maestro软件优化蛋白结构,然后用Hex软件进行蛋白对接,用Pymol作图并找出相互作用的氨基酸。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm