雷公藤甲素对百草枯诱导的肺纤维化的治疗作用研究

关键词:雷公藤甲素 百草枯 肺纤维化 耐思玻底培养皿20mm 独立灭菌玻底培养皿 灭菌TC玻底培养皿 硕华玻底培养皿15mm 硕华玻底培养皿20mm

 

1.2.2羟脯氨酸含量测定

(1)将小鼠左侧的肺组织取出,将周围的结缔组织用剪刀剪去,在福尔马林溶液中过夜固定;

(2)第二天,将肺组织在丙酮中浸8h后,更换为新的丙酮溶液过夜浸泡;

(3)然后更换为(1:1,V/V)的乙醇:乙醚的混合物浸泡后,60oC恒温条件下干燥至恒重。

(4)取上述干燥的肺组织12mg在研钵中研磨成粉末后,加入0.6mL6M的浓盐酸120oC条件下水解2h。然后用40%的NaOH调整溶液的pH值至6.0左右,然后加入纯水至溶液的终体积为1.5mL,最后在离心机中,12000rpm离心15min。取上清液,加入纯水稀释5倍后,取样品用于羟脯氨酸含量检测。

(5)采用氯氨-T法检测羟脯氨酸的含量。主要操作步骤如下:

a.取1mL待测样品,加入1mL纯水稀释成2mL,再加入1mL氯氨T溶液,混合均匀,室温孵育20min;

b.加入1mL3.5mol/L的高氯酸溶液,室温条件下孵育5min;

c.然后加入1mL10%的4-二甲氨基苯甲醛溶液混合均匀,并60℃条件下孵育20min;

d.上述溶液冷却至室温,检测550nm波长吸光度,参比溶液为10µg/mL的羟脯氨酸标准液。利用吸光度计算各个样品的羟脯氨酸含量;并根据羟脯氨酸的含量换算成胶原含量。换算标准:胶原含量=羟脯氨酸含量/12.5%(μg/mg)。

1.2.4苏木素-伊红(hematoxylineosin,HE)染色

主要操作步骤如下:

(1)二甲苯I、二甲苯II脱蜡,每次5~10min;

(2)梯度酒精水化(酒精含量从高到低),每个梯度5~10min;

(3)苏木精染色5~15min;

(4)1%盐酸酒精分化5~10s,切片由蓝变红;

(5)1%氨水返蓝;

(6)0.5%伊红染色,1~3min,自来水冲洗;

(7)梯度酒精脱水(酒精含量由低到高),每个梯度5~10min;

(8)二甲苯透明;

(9)树胶封片。

1.2.5Masson染色

Masson染色结果依据胶原的含量,进行分级;分级依据标准为:0级:正常;1级:轻微;2级:一般;3级:严重。主要操作步骤如下:(1)二甲苯I、二甲苯II脱蜡,每次5~10min;(2)梯度酒精水化(酒精含量由高到低),每个梯度5~10min;(3)依次使用自来水和蒸馏水洗;(4)Regaud苏木精染液染核5~10min,苏木精染液需要提前一周配制;(5)充分水洗,如过染可盐酸酒精分化;(6)蒸馏水洗;(7)Masson丽春红酸性复红液5-10min;(8)2%冰醋酸水溶液浸洗片刻;(9)1%磷钼酸水溶液分化3-5min;(10)苯胺蓝水溶液染色5min;(11)以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻;(12)梯度酒精脱水(酒精含量由低到高),每个梯度5~10min;(13)二甲苯透明;树胶封片。

1.2.6免疫组织化学分析

肺组织经脱水,石蜡包埋,切片(4μm),展片后(水温在42oC左右),用粘附性载玻片捞取组织,60oC环境下烘烤4h,抗体孵育,显色观察。结果判断:选取40×下随机5个视野,共计数>1000个,若细胞或胞浆出现特异性棕黄色,视为阳性细胞,阳性率评分(<1%,0分;1-10%,1分;10-50%,2分;50-80%,3分;>80%,4分);着色强度评分(无,0分;弱,1分;中,2分;强,3分)。免疫组化着色强度乘以阳性细胞率评分为该病理评分值。主要操作步骤如下:

(1)脱蜡:二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡,每次15min;

(2)水化:梯度酒精水化(酒精浓度由高到低),每个梯度5~10min;

(3)封闭:3%过氧化氢-甲醇溶液,30min(封闭内源性过氧化物酶活性);蒸馏水洗3遍,每次3min;

(4)抗原修复:用0.01mol/L柠檬酸钠抗原修复液(pH6.0),于微波中修复(95°C,15min),室温自然冷却;PBS洗3遍,每次3min;

(5)血清封闭:10%正常胎牛血清室温孵育30min;PBS洗3遍,每次3min;

(6)第一抗体孵育:稀释及滴加一抗Vimentin(1:100)、α-SMA(1:100)、E-cad(1:100),湿盒内4°C冰箱过夜;

(7)次日,取出湿盒,待恢复至室温后,PBS冲洗三次,每次3min;

(8)增强剂孵育:每张切片加一滴增强剂(链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物),室温下孵育20min;PBS冲洗三次,每次3min;

(9)第二抗体孵育:滴加二抗,室温孵育30min;

(10)DAB显色:滴加新鲜配制的DAB显色剂(0.05%DAB+0.03%H2O2),镜下控制显色时间;

(11)苏木素复染,0.5%盐酸酒精分化,PBS液漂洗返蓝;

(12)切片脱水,中性树胶封片,镜检。

(13)镜下阅片:观察染色强度,并计算阳性细胞数。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm