激活自噬对Kupffer细胞中NLRP3炎症小体激活的影响

发布时间:2020-06-29 浏览次数: TAG: 自噬 Kupffer细胞 NLRP3 炎症小体 微量离心管 离心管 血清移液管

关键词:自噬 Kupffer细胞 NLRP3 炎症小体 微量离心管  离心管  血清移液管

 

1.2.1.3.提取肝脏非实质细胞

(1)剪去胆囊及多余结缔组织,清洗肝脏并转移至预先配好的37℃胶原酶工作液中。双手持显微外科镊,一把固定肝脏,另一把快速将肝脏划碎,5min内将肝脏划成尽可能小的均匀碎块。过程中不可钳夹肝脏组织,以免损伤细胞。

(2)碎肝后,用10ml移液管将肝脏混合液转移至10ml离心管中,37℃水浴30分钟,每10min吹打一次,消化呈稀糊状。

(3)最后一次提前3min取出,吹打均匀后,用200目金属滤网过滤至10cm无菌培养皿,然后用移液管移至10ml离心管。

(4)将盛有细胞悬液的10ml离心管放入低温离心机,4℃,300g,离心5min;小心吸去上清液,加入适量DMEM至10ml左右,移液管吹打重悬细胞。

(5)低温离心机,4℃,300g,离心5min;小心吸去上清液,加入适量DMEM至10ml左右,移液管吹打重悬细胞。

(6)低温离心机,4℃,50g,离心3min;将上清液转移至新的无菌离心管,弃去主要为肝细胞的沉淀。

(7)低温离心机,4℃,300g,离心5min;小心吸去上清液,加入适量DMEM至10ml左右,移液管吹打重悬细胞,种于六孔板或者25T细胞培养瓶中。

(8)将细胞放入37℃,5%CO2的细胞孵育箱中培养。

1.2.1.4.选择性贴壁法纯化KCs

2h后取出六孔板,小心吸去培养基,轻轻加入PBS清洗细胞2次,洗去未贴壁细胞和其他肝脏非实质细胞。24h后换液,观察细胞形态1.2.5RT-qPCR检测Atg5、Atg7、Beclin-1、P62、NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA表达

1.2.5.1.提取KCs的总RNA

(11)收集六孔板培养细胞的上清液,存于-80℃冰箱备用。向每孔加入冰PBS洗涤细胞3次后吸干,紧接着每孔加入200μlRL裂解液,并用移液枪轻轻吹打,将贴壁细胞吹下并与裂解液混匀,转入1.5ml无酶EP管中。

(12)将混合液剧烈震荡混匀,在室温下孵育5min使核蛋白体完全分解。4℃低温高速离心机12000rpm离心10min,小心将上清转入新的1.5ml无酶EP管中。

(13)给每管加入40μl(RL:氯仿=5:1)氯仿,盖紧管盖剧烈震荡15min后室温孵育3min。

(14)4℃低温高速离心机12000rpm离心10min,样品分为上、中、下三层:上、中层为水相,下层为有机相,RNA存在于上层无色水相中,将其转移到新无酶EP管中。

(15)加入一倍体积70%乙醇,颠倒混匀并全部转移到吸附柱RA中。

(16)4℃,10000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新套入收集管,加入500μl去蛋白液RE,4℃,12000rpm离心1min,弃废液。

(17)接着加入700μl漂洗液,,4℃,12000rpm离心1min,弃废液;再加入500μl漂洗液,,4℃,12000rpm离心1min,弃废液。

(18)将吸附柱套入空收集管,4℃,12000rpm离心2min,并在空气中放置3min,以尽量去除漂洗液。

(19)取出吸附柱RA放入新无酶EP管中,在吸附膜中间位置加入事先预热至65-70℃的无酶水50μl,室温放置2min,4℃,12000rpm离心1min。

(20)将所得溶液重新加入吸附膜中间,4℃,12000rpm离心1min。所得溶液内含KCs总RNA,冻存于-80℃冰箱备用。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm