NLRP3炎症小体和自噬在NASH患者和小鼠肝脏中的表达

发布时间:2020-06-29 浏览次数: TAG: NLRP3 炎症小体 自噬 NASH 小鼠 肝脏 微量离心管 离心管 血清移液管

关键词:NLRP3 炎症小体 自噬 NASH 小鼠 肝脏 微量离心管  离心管  血清移液管

 

1.2.3组织学染色

1.2.3.1.HE染色

将福尔马林固定的人和小鼠的肝脏组织标本进行洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋、修块、切片、展片贴片,制成石蜡切片。HE染色流程如下:

(1)脱蜡与水化:将切片放入60℃恒温箱烤片30min以使蜡融化;然后依此放入二甲苯I、II中各10min脱蜡;再依此放入无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇,各3-5min;最后放入蒸馏水中水化3min。

(2)HE染色:将苏木素染液滴于组织上,完全覆盖组织,染色5min,立即后流动自来水轻轻冲洗10min,再用蒸馏水洗涤一遍;然后95%乙醇5s;弃去乙醇后滴入伊红染液染色2min。

(3)脱水、透明、封片:自来水冲洗后,将切片依此放入95%乙醇I、II,无水乙醇I、II中各2min脱水;然后先后放入二甲苯I、II中各5min透明;最后用中性树胶封片。

1.2.3.2.油红染色

人体肝脏和小鼠肝脏取出后迅速浸入冰冻切片专用胶水中,速冻后切片,厚度为6-10μm。制作要的冰冻切片可冻于-80℃冰箱备用。油红染色步骤如下:

(1)配置工作液:按饱和油红O原液:蒸馏水=3:2配制,混匀后室温放置10min后过滤备用。

(2)冰冻切片用10%福尔马林固定10min后用蒸馏水稍冲洗。

(3)把切片放入60%异丙醇浸洗30s;

(4)将切片放入盛有配制好的油红O染液的容器内,密闭染色15min;

(5)用60%异丙醇稍清洗切片,分色至间质清晰,再用蒸馏水稍清洗;

(6)用Mayer苏木素复染核1min后用蒸馏水稍微清洗;

(7)用滤纸吸干组织周围水分,甘油明胶封固。

1.2.4透射电镜取材

将离体的人或小鼠肝脏迅速放于培养皿内,并立即滴上重庆医科大学电镜室领取的固定液。用新开封的双面刀片切割组织,切时需一刀切,切勿来回牵拉,镊子钳夹持过的肝组织已变形,需淘汰。组织块应切割成1mm×1mm×1mm的规则小块,5-8块。切割完成后的标本需立即放入盛有固定液的标本瓶内,整个过程要在1min之内,然后放入4℃冰箱中保存,可保存3-6个月。收集各组标本后,送重庆医科大学电镜室进行标本制作与图像采集。

1.2.5WesternBlot检测LC3、Beclin-1、P62、NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白的表达

1.2.5.1.提取细胞总蛋白

为防止蛋白降解,蛋白提取过程需在冰上进行。配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1。从液氮中取出肝脏组织约50-100mg,放入消毒过的研钵中磨碎,研磨过程中可向组织加入少量液氮,以保持组织干燥以及避免蛋白降解。将研磨碎的组织转移至装有1ml配置好裂解液的1.5mlEP管中,置于冰上,并用加样枪反复吹打15min,可适当延长裂解时间。充分裂解后,4℃低温离心机12000rpm离心10min。上清即为含总蛋白质溶液,将其转移至新EP管中,并吸取3×2μl加入96孔板中用于蛋白浓度测定。向EP管中加入loadingbuffer(5×)(蛋白:loadingbuffer=4:1),开水煮沸8-10min,使蛋白充分变性,冷却后冻于-80℃冰箱。

1.2.5.2.总蛋白浓度BCA测定

(1)配置BCA工作液:试剂A:试剂B体积=50:1,每孔200μl,混匀后待用。

(2)用90μlPBS将10μl蛋白标准品(浓度5mg/ml)稀释至0.5mg/ml,然后按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板蛋白标准品孔中,加双蒸水补足至20μl。

(3)向96孔板待测样品孔每孔加入双蒸水18μl和待测样品2μl,混匀,每组三个平行。

(4)向每孔加入BCA工作液200μl,混匀,37℃温浴30min,冷却至室温。

(5)将96孔板放入酶标仪测定562nm波长下吸光度,制作标准曲线,从标准曲线中求得待测样品蛋白浓度。

1.2.5.3.WesternBlot相关试剂配制

10%过硫酸铵(10%AP):AP0.1g+超纯水1ml,-20℃保存。

1×SDS电泳缓冲液:电泳缓冲液粉末加蒸馏水至1000ml,充分溶解后室温或4℃保存。

1×转膜缓冲液:转膜缓冲液粉末加200ml甲醇和800ml蒸馏水,溶解后室温或4℃保存。

TBST:TBS粉末+1mlTween-20,加蒸馏水至1000ml,溶解后室温保存。

封闭液:BSA粉末2.0g+TBST40ml,混匀后于4℃保存。

1.2.6RT-qPCR检测Atg5、Atg7、Beclin-1、P62、NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA表达

1.2.6.1.提取总RNA

(1)从液氮中取出肝脏组织约50-100mg,放入消毒过的研钵中磨碎,研磨过程中可向组织加入少量液氮,以保持组织干燥以及避免蛋白降解。将研磨碎的组织转移至装有1mlRL裂解液的1.5mlEP管中。

(2)置于冰上,并用加样枪反复吹打或剧烈震荡混匀15min,可适当延长裂解时间,使核蛋白体完全分解。4℃低温高速离心机12000rpm离心10min,小心将上清转入新的1.5ml无酶EP管中。

(3)给每管加入40μl(RL:氯仿=5:1)氯仿,盖紧管盖剧烈震荡15min后室温孵育3min。

(4)4℃低温高速离心机12000rpm离心10min,样品分为上、中、下三层:上、中层为水相,下层为有机相,RNA存在于上层无色水相中,将其转移到新无酶EP管中。

(5)加入一倍体积70%乙醇,颠倒混匀并全部转移到吸附柱RA中。

(6)4℃,10000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱重新套入收集管,加入500μl去蛋白液RE,4℃,12000rpm离心1min,弃废液。

(7)接着加入700μl漂洗液,,4℃,12000rpm离心1min,弃废液;再加入500μl漂洗液,,4℃,12000rpm离心1min,弃废液。

(8)将吸附柱套入空收集管,4℃,12000rpm离心2min,并在空气中放置3min,以尽量去除漂洗液。

(9)取出吸附柱RA放入新无酶EP管中,在吸附膜中间位置加入事先预热至65-70℃的无酶水50μl,室温放置2min,4℃,12000rpm离心1min。

(10)将所得溶液重新加入吸附膜中间,4℃,12000rpm离心1min。所得溶液内含KCs总RNA,冻存于-80℃冰箱备用。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm