肿瘤相关巨噬细胞对HCC细胞生长及转移的作用及机制研究

发布时间:2020-06-29 浏览次数: TAG: 肿瘤 巨噬细胞 HCC 细胞生长 微量离心管 离心管 血清移液管

关键词:肿瘤 巨噬细胞 HCC 细胞生长 微量离心管  离心管  血清移液管

 

1.2方法

1.2.1细胞培养

从液氮取出细胞株后,37℃水浴箱迅速解冻,1000g离心5min,HepG2、Huh-7细胞培养在含有10%胎牛血清(Gibco)的1640培养基(Gibco),置于37℃、5%CO2浓度细胞培养箱中。

1.2.2M1/M2巨噬细胞与HCC细胞共培养

将人PBMC细胞诱导分化的M1/M2巨噬细胞分别与HCC细胞共培养,将0.4μmTranswell小室(仅可溶性细胞因子可以通过该小室)置于六孔板中,分别接种1×105个M1/M2型巨噬细胞到小室内,接种3×105个HCC细胞到六孔板后共培养7d,建立共培养体系。

1.2.3细胞转染

按照LipofectamineTM2000(Invirtogen)试剂说明书的要求进行细胞转染的操作,分别混匀脂质体、质粒和无血清的培养基,或miR-101mimics,或miR-101inhibitor,或干扰序列siRNA,或各自的阴性对照,加入无血清的培养基,培养4-6h后换为含血清的培养基。siRNA及其阴性对照转染的终浓度为100nM,miR-101mimics或inhibitor及其阴性对照转染的终浓度为50nM。

1.2.4CCK-8细胞增殖实验

实验原理:CCK-8实验是一种基于WST-8,用于快速检测细胞增殖的灵敏方法。WST-8可在某些电子耦合物作用下被细胞线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。可根据颜色的深浅来判断细胞增殖的情况,颜色深浅与细胞的数目呈线性关系。

实验操作步骤:

(1)HepG2及Huh-7细胞单独培养或与M1/M2巨噬细胞共培养7d,待HCC

细胞处于对数生长期,胰酶消化后收集,用RPMI1640培养基轻轻吹打,制成浓度为2×l04个/m1的单细胞悬液;(2)将HCC细胞按照4×l03个细胞/孔的数量接种到96孔板对应的孔中,每组每个孔板设三个复孔;

(3)HCC细胞培养在37℃,5%CO2培养箱,培养一定时间,加入20μlWST-8到对应的孔中,37℃继续培养2h,酶标仪测定光密度值,绘制相应的时间-效应曲线。

1.2.5细胞迁移实验

(1)将孔径为8.0μm的Transwellchamber24孔板和细胞培养试剂置于37℃温育;

(2)HepG2及Huh-7细胞单独培养或与M1/M2巨噬细胞共培养7d,待HCC细胞处于对数生长期,胰酶消化后收集,无血清RPMI1640培养基轻轻吹打,制备成2×105个细胞/ml的单细胞悬液;

(3)在Transwellchamber上室加入100-150μl细胞悬液,下室加入600-800μl含10%血清的培养基,置于培养箱24h;

(4)小心取出chamber,并将上室液体小心吸干,置于含有800μl甲醇的孔中进行固定,室温放置30min;

(5)取出chamber,小心吸干上室甲醇,置于含有800μlGiemsa染液的孔中进行染色,室温放置15-30min;

(6)小心清水冲洗几次,轻轻取出chamber,并将上室液体小心吸干,医用棉签轻轻拭去残留的细胞;

(7)用镊子轻轻揭下底部膜,底面朝上晾干,用中性树胶封片;

(8)随机选取5个高倍视野,计数视野中的细胞总数,统计结果。

1.2.6细胞侵袭实验

(1)Matrigel置于4℃过夜融化;

(2)无血清RPMI1640培养基置于4℃预冷,用培养基将Matrigel终浓度调整为1mg/ml;

(3)将100μl稀释后的Matrigel加入到chamber上室底部中央,37℃温育4-5h使其干成胶状;

(4)将孔径为8.0μm的Transwellchamber24孔板和细胞培养试剂置于37℃温育;

(5)HepG2及Huh-7细胞单独培养或与M1/M2巨噬细胞共培养7d,待HCC细胞处于对数生长期,胰酶消化后收集,无血清RPMI1640培养基轻轻吹打,制备成2×105个细胞/ml的单细胞悬液;

(6)在Transwellchamber上室加入100-150μl细胞悬液,下室加入600-800μl含10%血清的培养基,置于孵箱培养24h;

(7)小心取出chamber,并将上室液体小心吸干,置于含有800μl甲醇的孔中进行固定,室温放置30min;

(8)取出chamber,小心吸干上室甲醇,置于含有800μlGiemsa染液的孔中进行染色,室温放置15-30min;

(9)小心清水冲洗几次,轻轻取出chamber,并将上室液体小心吸干,医用棉签轻轻拭去残留的细胞;

(10)用镊子轻轻揭下底部膜,底面朝上晾干,用中性树胶封片,随机选取5个高倍视野,计数视野中的细胞总数,统计结果。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm