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RNA-seq检测
发布时间:2019-04-18 16:02:07| 浏览次数:
TAG: RNA-seq 检测

    关键词:RNA-seq;检测

     

    收集对数生长期细胞,提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定提取RNA的完整性。用带有ologo(dT)的磁珠富集mRNA,用试剂盒去除rRNA,向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片段成为段片段,再以片段后的mRNA为模板,合成cDNA第一链,加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA polymerase I合成cDNA的第二条链,经过QiaQuick PCR试剂盒纯化,加入EB缓冲液洗脱经末端修复、加A碱基,加测序接头,再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段,并进行PCR扩增,整个文库制备工作完成。构建好的文库采用Illumina HiSeq2000进行测序。标准信息分析:对原始数据进行去除接头序列及低质量reads的处理;测序评估(数据比对统计,测序饱和度分析,测序随机性的统计分析,reads在参考基因上的分布分析);基因表达注释;差异表达基因分析(差异表达基因筛选,实验重复性分析,两个或两个以上样品);组间差异表达基因分析(至少2组样本,每组至少3个生物学重复);差异基因表达模式聚类分析(包括两两差异基因聚类分析和组间差异基因聚类分析)。GO功能显著性富集分析;Pathway显著性富集分析。


 
 
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