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凝胶转膜及其检测
发布时间:2019-04-10 12:01:54| 浏览次数:
TAG: 转膜 检测

    关键词:转膜;检测

    凝胶电泳结束后,将凝胶上分离的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上。Western 印迹法的固相支持物多种多样,本实验采用的固相支持物为PVDF 膜。待蛋白条带转移至固相支持物上, 然后分别用非标记一抗抗体与固相支持物上相应蛋白条带特异结合,然后在与辣根过氧化物酶标记的二抗抗体对其进行反应,然后与底物孵育,检测。实验中采用的转模方式为半干转的转膜方式。

    2.9.5.1 PVDF 膜的预处理:先置于100%甲醇中浸泡2-3 分钟,水、电转液依次漂洗2 分钟×2 次,置于电转液中备用;

    2.9.5.2 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸,用转移缓冲液浸泡后待用;

    2.9.5.3 将电泳板取下,注意使“凹”面玻璃板在下,将其平置,小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板,切除多余凝胶,将含样品胶用电转缓冲液漂洗一次;

    2.9.5.4 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中:由阴极侧开始,依次为海绵垫片、3 层滤纸、样品胶、PVDF 膜、三层滤纸、海绵垫片(注意:各层之间应无气泡),扣紧转膜夹板,放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中;

    2.9.5.5 正确连接转移电泳连线,保证电荷由负极向正极流动。转膜条件:电流为130ma,电压为20v 左右,转膜时间为30 分钟。

    2.9.5.6 封闭:电转结束后,小心取出转移膜,TBST 洗膜一次,将膜置于封闭液中,室温,摇床上缓慢摇动状态下封闭1 小时,以减少非特异性结合,降低背景。

    2.9.5.7 一抗反应:将封闭后的膜直接放入兔抗小鼠Bcl-2 或Caspas-3 的一抗抗体工作液(抗体用封闭液稀释,稀释度为1:500;内参抗体稀释度为1:1000);4℃反应过夜.

    2.9.5.8 洗膜:将反应膜放入平皿中,用1×TBST 洗涤三次,(室温下缓

    慢摇动洗涤),每次摇动时间为10 分钟,洗净未结合的一抗;

    2.9.5.9 二抗反应:将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液(1:3000)中,在室温下、缓慢摇动作用时间为60 分钟;

    2.9.5.10 洗膜:用1×TBST 洗膜,方法同(8),洗去游离二抗;

    2.9.5.11 曝光及洗片;

    2.9.5.12 用image J 软件分析灰度值。


 
 
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