[摘要]目的制备能与肾癌相关抗原G250胞外区特异性结合的纳米抗体。方法通过瞬时转染方式将包含G250蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞HEK293F中表达G250胞外区,以该重组蛋白免疫新疆双峰驼,构建噬菌体展示纳米抗体库。通过体外定向筛选,得到能与G250蛋白胞外区特异性结合的噬菌体,以MonoclonalphageELISA方法筛选出具有结合活性的噬菌体克隆。通过细胞ELISA和流式细胞仪再次验证淘选到的纳米抗体的细胞结合活性。结果测序证明编码G250的重组DNA片段序列正确,Westernblot检测结果证实G250重组蛋白成功表达。通过免疫新疆双峰驼,成功构建了库容为2.87×109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库。在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选,使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,阳性率高达54.3%。经过抗原ELISA、细胞ELISA鉴定,筛选出3个具有细胞结合活性的纳米抗体噬菌体克隆,取其中结合活性最高的Nb-G5进行表达、纯化,产量为1.5mg/L培养物,流式细胞仪检测结果证实Nb-G5与G250表达阳性的细胞具有很强的特异性结合能力。结论从纳米抗体库中淘选得到了在分子和细胞水平均能与G250蛋白胞外区特异性结合的纳米抗体。
       
       [关键词]纳米抗体;肾癌相关抗原G250;噬菌体展示;骆驼
       
       
       3讨论
       Hamers-Casterman等[7]在1993年发现,骆驼抗体天然缺失轻链,只含有重链,因此又称重链抗体(heavychainantibodies,HCAbs)。另有研究者发现,骆驼抗体中还缺少CH1,克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体,称为VHH抗体[8]。VHH晶体相对分子质量为15×103,仅为常规抗体的1/10左右,直径2.5nm,长4nm,因此又称为纳米抗体(nanobody,Nb)[9],是自然存在的可与抗原结合的最小片段。其主要特点有:①在体内具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力;②纳米抗体的制造较单克隆抗体容易,并且制造成本低、产量大;③它的免疫原性很低,在动物实验中,纳米抗体的重复给药未检测到任何体液和细胞免疫反应。纳米抗体具有的颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高等特点,以及表面效应、尺寸效应和宏观量子隧道效应,使得纳米抗体在诸多方面均优于传统抗体[10],对疾病的检测、诊断和治疗具有潜在的、极高的应用价值,具有广阔的应用前景[4]。
       肾癌相关抗原G250于1986年被发现并对其进行了系统、深入的研究,G250抗原具有良好的肾癌特异性。免疫组化研究表明:85%以上的原发性肾癌和转移性肾癌表达G250抗原,而占肾癌90%的肾透明细胞癌几乎全部表达此抗原,正常的肾组织则不表达G250抗原[1]。G250属于单次跨膜蛋白,位于VHL肿瘤抑制基因的下游,由缺氧诱导因子-1途径激活[11-12]。